繼續教育百科名片 用藥敏實驗進行藥物敏感度的測定，以便準確有效的利用藥物進行治療。但由于藥敏試驗要求比較嚴格，條件比較高，僅僅在大中專院校或科研單位有條件的可以操作，一些養殖廠或一些門診難有條件進行藥敏試驗的操作。針對這個問題，農業部動物檢疫所青島易邦生物工程有限公司動物疫病診療中心經過幾年的總結和實踐，逐漸總結出幾套適合基層進行藥敏試驗的操作方法。目前，臨床微生物實驗室進行藥敏試驗的方法主要有紙片擴散法，稀釋法（包括瓊脂和肉湯稀釋法），抗生素濃度梯度法（E-test法），和自動化儀器等。 藥敏試驗介紹 抗菌藥對細菌性傳染病的控制起到了非常重要的作用，但由于養殖過程中不科學的、盲目的濫用抗菌藥，很多致病性細菌產生了耐藥性，使得抗菌藥對細菌性疾病的控制效果越來越差，不但造成藥物浪費，而且還延誤病情，給養殖戶造成了很大的經濟損失。 隨著新型致病菌的不斷出現，抗菌藥的防治效果越來越差。并且各種致病菌對不同的抗菌藥物的敏感性不同，同一細菌的不同菌株對不同抗菌藥物的敏感性也有差異。長期以來，各種致病菌耐藥性的產生使各種常用抗菌藥物往往失去藥效，以及不能很好的掌握藥物對細菌的敏感度，所以一個正確的結果，可供臨床醫師選用抗菌藥物的參考，并提高療效。農業部動物檢疫所青島易邦生物工程有限公司動物疫病診療中心總結出幾套適合基層進行藥敏試驗的操作方法，現簡單介紹如下。 藥敏試驗分類 一、 紙片擴散法 該法是將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了測試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物在瓊脂中擴散，隨著擴散距離的增加，抗菌藥物的濃度呈對數減少，從而在紙片的周圍形成濃度梯度。同時，紙片周圍抑菌濃度范圍內的菌株不能生長，二抑菌范圍外的菌株則可以生長，從而在紙片的周圍形成透明的抑菌圈，不同的抑菌藥物的抑菌圈直徑因受藥物在瓊脂中擴散速度的影響而可能不同，抑菌圈的大小可以反映測試菌對藥物的敏感程度，并與該藥物對測試菌的MIC呈負相關。 二、稀釋法 稀釋法藥敏試驗可用于定量測試抗菌藥物對某一細菌的體外活性，分為瓊脂稀釋法和肉湯稀釋法。實驗時，抗菌藥物的濃度通常經過倍比（lg2）稀釋，能抑制待測菌肉眼可見生長的最低藥物濃度成為最小抑菌濃度（MIC），一個特定抗菌藥物的測試濃度范圍應該包含能夠檢測細菌的解釋性折點（敏感、中介和耐藥）的濃度，同時也應該包含質控參考菌株的MIC. 2.1 瓊脂稀釋法 首先制備含抗菌藥物的瓊脂稀釋平板。再接種待測菌株，然后是結果判讀。 2.2 肉湯稀釋法 三、抗生素濃度梯度法 四、自動化儀器法 實驗步驟 一、實驗材料 普通營養瓊脂培養基：可去生化試劑店購買，做不同細菌的藥敏試驗可選擇不同的培養基，如做大腸桿菌的藥敏試驗可選擇普通營養瓊脂或麥糠凱培養基。做沙門氏菌可選擇血清培養基。 藥敏試紙：購買或自制（詳見實驗準備） 細菌：待做藥敏試驗的細菌 儀器：接種環、酒精燈、打孔器、牛津杯、移液器、滴頭 二、實驗準備 2.1 藥敏片的準備：購買或自制 2.1.1 制備方法：取新華1號定性濾紙，用打孔機打成6毫米直徑的圓形小紙片。取圓紙片50片放入清潔干燥的青霉素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包扎。經15磅15-20分鐘高壓消毒后，放在37℃溫箱或烘箱中數天，使完全干燥。 2.1.2 抗菌藥紙片制作：在上述含有50片紙片的青霉素瓶內加入藥液0.25毫升，并翻動紙片，使各紙片充分浸透藥液，翻動紙片時不能將紙片搗爛。同時在瓶口上記錄藥物名稱，放37℃溫箱內過夜，干燥后即密蓋，如有條件可真空干燥。切勿受潮，置陰暗干燥處存放，有效期3-6個月。 2.2 藥液的制備（用于商品藥的試驗）：按商品藥的使用治療量的比例配制藥液；如商品藥百病消按其說明量治療量0.01%飲水，可按這個比例配制藥液，可取10毫克加入10毫升的水中混勻。此稀釋液即為用于做藥敏試驗的藥液。 三、實驗操作方法 3.1 藥敏片法 3.1.1 在“超凈臺”中，用經（酒精燈）火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，以劃線方式將細菌涂布到平皿培養基上。具體方式；用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點涂菌，以每點開始劃線涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布于平皿。（另：可挑取待試細菌于少量生理鹽水中制成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液涂布于平皿培養基表面。要求涂布均勻致密，直接懸液法要把菌液濃度用生理鹽水或PBS調到0.5個麥氏標準再涂布均勻。） 3.1.2 將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養基表面。為了使藥敏片與培養基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了使能準確的觀察結果，要求藥敏片能有規律的分布于平皿培養基上；一般可在平皿中央貼一片，外周可等距離貼若干片（外周一般可貼七片），每種藥敏片的名稱要記住。 3.1.3 將平皿培養基置于37℃溫箱中培養24小時后，觀察效果。 3.2 牛津杯法 3.2.1 在“超凈臺”中，用經（酒精燈）火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，以劃線方式將細菌涂布到平皿培養基上。具體方式；用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點涂菌，以每點開始劃線涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布于平皿。（另：可挑取待試細菌于少量生理鹽水中制成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液涂布于平皿培養基表面。要求涂布均勻致密。） 3.2.2 以無菌操作將滅菌的不銹鋼小管（內徑6nm、外徑8nm、高10nm的圓形小管，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養基上，輕輕加壓，使其與培養基接觸無空隙，并在小管處標記各種藥物名稱。每個平板可放4-6支小管。待分鐘后，分別向各小管中滴加一定數量的各種藥液，勿使其外溢。置37℃培養8-18小時，觀察結果。 3.2.3 將平皿培養基置于37℃溫箱中培養24小時后，觀察效果。 3.3 打孔法： 該法較簡單，成本低，易操作，比較適用于商品藥物的檢測。 3.3.1 在“超凈臺”中，用經（酒精燈）火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，以劃線方式將細菌涂布到平皿培養基上。具體方式；用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點涂菌，以每點開始劃線涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布于平皿。（另：可挑取待試細菌于少量生理鹽水中制成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液涂布于平皿培養基表面。要求涂布均勻致密。） 3.3.2 以無菌操作將滅菌的不銹鋼小管（外徑為4毫米、孔徑與孔距均為3毫米，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養基上打孔，將孔中的培養基用針頭挑出，并以火焰封底，使培養基能充分的與平皿融合（以防藥液滲漏，影響結果）。 3.3.3 加樣：按不同藥液加樣，樣品加至滿而不溢為止。 3.3.4 將平皿培養基置于37℃溫箱中培養24小時后，觀察效果。 結果觀察 在涂有細菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內向四周擴散，其濃度呈梯度遞減，因此在紙片周圍一定距離內的細菌生長受到抑制。過夜培養后形成一個抑菌圈，抑菌圈越大，說明該菌對此藥敏感性越大，反之越小，若無抑菌圈，則說明該菌對此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、劃線細菌濃度有直接關系。 判定標準 一、藥敏實驗的結果，應按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標準。 表1 藥物敏感實驗判定標準 抑菌圈直徑（毫米） 敏感度 20以上 極敏 15~20 高敏 10~14 中敏 10以下 低敏 0 不敏 具體對于不同的菌株，及不同的抗生素紙片需參照NCCLs的標準或者CLSI標準。 二、藥物敏感實驗判定標準參考表1，多黏菌素抑菌圈；在9毫米以上為高敏，6—9毫米為低敏，無抑菌圈為不敏。 影響藥敏結果的因素 一、培養基：應根據試驗菌的營養需要進行配制。傾注平板時，厚度合適（約5-6mm），不可太薄，一般90mm直徑的培養皿，傾注培養基18-20ml為宜。培養基內應盡量避免有抗菌藥物的拮抗物質，如鈣、鎂離子能減低氨基糖苷類的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和對氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺藥和TMP的活性。 二、細菌接種量：細菌接種量應恒定，如太多，抑菌圈變小，能產酶的菌株更可破壞藥物的抗菌活性。 三、藥物濃度：藥物的濃度和總量直接影響抑菌試驗的結果，需精確配制。商品藥應嚴格按照其推薦治療量配制。 四、培養時間：一般培養溫度和時間為37℃ 8-18小時，有些抗菌藥擴散慢如多粘菌素，可將已放好抗菌藥的平板培養基，先置4℃冰箱內2~4小時，使抗菌藥預擴散，然后再放37℃溫箱中培養，可以推遲細菌的生長，而得到較大的抑菌圈。 藥敏試驗的應用 藥物敏感實驗后，應選擇高敏藥物進行治療，也可選用兩種藥物協助使用，以減少耐藥菌株。在選擇高敏藥物時應考慮藥物的吸收途徑，因為我們藥敏實驗是藥液直接和細菌接觸，而在給禽用藥的時候，必須通過機體的吸收才能使藥物達到一定的效果，所以在給禽用藥時，高敏藥物一定要配合適宜的給藥方法，這樣才會達到好的治療效果。
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