甲胎蛋白化學發光免疫定量分析方法的建立

文章來源：發布時間：2009年10月09日瀏覽量：次 字體： 大 中 小

甲胎蛋白化學發光免疫定量分析方法的建立

發布日期：2009-9-14   來源：轉載

【摘要】  目的： 建立檢測甲胎蛋白化學發光免疫定量分析方法. 方法： 采用雙抗體異位點一步夾心法，以甲胎蛋白單克隆抗體作為固相包被，采用改良過碘酸鈉法進行甲胎蛋白多克隆抗體與堿性磷酸酶偶聯制備酶標抗體；以金剛烷胺衍生物CSPD作為底物，優化CSPD與SapphireII發光體系；用國家標準品校定定量標準品，建立了人血清AFP的化學發光免疫定量分析法. 用該法檢測800份正常人血清，確定正常值參考范圍，將臨床血清標本100份與bayer Acs: 180全自動發光體系統進行比較. 結果： 本方法的最低檢出量為2.0 ng /mL，線性范圍2.0~600.0 ng/mL,批內和批間的變異率分別為6.7%和7.7%，回收率在98.2%~102.5%之間. 與CEA(3 μg/mL)的交叉≤0.15%；與鐵蛋白(10 μg /mL) ≤0.04%；與人血清白蛋白（200 g/L）≤2.5×10-8，與人血清丙球蛋白（100 g/L）≤2.0×10-8，與bayer Acs:180比較相關系數r=0.994（P<0.001）. 結論： 建立的甲胎蛋白化學發光免疫分析法可常規用于臨床檢測.

【關鍵詞】  甲胎蛋白類；化學發光測定法；定量分析

　　Establishment of chemiluminescent immunoassay for determination of alphafetoprotein

　　FENG YanMing, MA JunFen, WU Biao, GUO LanYing, WU YongJun, LI ZhiTao,  WU YiMing

　　1Department of Labour Health and Occupational Public Health Institution,  Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China, 2SinoAmerican Biology Company, Luoyang, 471003, China

　　【Abstract】 AIM:  To establish a method of chemiluminescent immunoassay for determination of alpha fetoprotein(AFP) in human serum.  METHODS: The twosite enzyme immunoassay is based on the direct sandwich technique. A monoclonal antibody was bonded to the microplate for coating and the conjugation of alkaline phosphatase to another polyclonal antibody was performed by NaIO4 method. Chemiluminescent immunoassay was established by optimizing CSPD and SapphireII luminescent system. Sensitivity, linear scope, precision, interference and recovery for the method were evaluated. The reference range was defined by testing 800 serum samples from healthy subjects.The comparison for 100 serum samples from patients was assayed by the bayer Acs:180 Automated Immunoassay system. RESULTS: The detectable minimum was 2.0 ng/mL. The linear scope was from 2.0 to 600.0 ng/mL. Average inter and intraassay were 7.7% and 6.7%, respectively. The recoveries ranged from 98.2% to 102.5%. The crossreacting rate for CEA(3 μg/mL), Ferritin(10 μg /ml), HAS(200 g/L), IgG(100 g/L) were≤0.15%, 0.04%, 2.5×10-8 and 2.0×10-8, respectively. Compared with bayer Acs:180 Automated immunoassay system, the relative coefficient was 0.994（P<0.001）. CONCLUSION: A successful establishment of chemiluminescent immunoassay provides a way for clinical determination of AFP.

　　【Keywords】  alphafetoproteins; chemiluminescent  measurements; quanti tative analysis

　　引言

　　甲胎蛋白（AFP）為最常用的腫瘤標志物之一. 是目前最好的可實際用于早期診斷原發性肝癌的指標，可在癥狀出現前6~12 mo作出診斷. 其他一些轉移性肝癌及肝外腫瘤如睪丸腫瘤， 卵巢腫瘤，胃癌，胰腺癌，結腸癌，支氣管癌，腎癌，乳腺癌和白血病等血液中的AFP也可增高. AFP屬糖蛋白，分子量70000，含糖40 g/L，正常人血清AFP含量在2~8 μg/L之間，AFP正常值一般低于25 μg/L;本文根據化學發光免疫分析法的原理建立并研制了甲胎蛋白化學發光定量測定試劑盒，現將結果報道如下.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　抗AFP單抗腹水購自OEM公司；AFP多克隆抗體為自制；AFP純品抗原購自Fitzgeral公司；堿性磷酸酶（ALP）由華美生物工程公司提供；化學發光底物CSPD及增強劑購自PE公司；過碘酸鈉（NaIO4）、硼氫化鈉（NaBH4）、乙二醇、2，4二硝基氟苯（DNFB）均購自Sigma；Sephadex G200凝膠柱層析購自LKB公司，DE52離子交換柱購自Sigma，聚苯乙烯塑料白色不透明微孔板購自深圳金燦華；luminescent化學發光儀（芬蘭雷勃）；洗板機（BioRad）；AFP國家標準品購自中國藥品生物制品檢定所.  標本均為血清，清亮無溶血，-20℃凍存. 分別為健康體檢門診的成年男性200份，成年女性（非妊娠女性）200份，青少年200份，老年人標本200份，其中男女比例為1∶1；臨床標本100份是陜西省人民醫院放免科采集的腫瘤或疑似患者血清.

　　1.2方法

　　1.2.1AFP單克隆抗體的純化抗AFP單抗腹水用500 g/L的飽和硫酸銨沉淀，再溶解透析后DE52換柱純化，分部收集,測定蛋白濃度. 蛋白濃度應在4~10 g/L之間，無菌過濾，加1 g/L NaN3后分裝. -20℃存放.

　　1.2.2AFP多抗血清制備與純化純品AFP免疫健康雄性山羊，首次劑量0.5 mg/只. 4 wk后加強免疫,劑量減半，共加強免疫3次. 耳靜脈采血測定效價，雙擴散效價>1∶128的羊，進行心臟采血，分離血清，羊抗AFP血清按照1.3.1方法進行純化.

　　1.2.3堿性磷酸酶標記抗體的制備采用改良過碘酸鈉乙二醇法進行標記［1］，將獲得的IgGALP用含100 g/L小牛血清的0.05 mol/L (pH 7.6)TBS緩沖液按1∶1000稀釋成工作液，保存于-20℃.

　　1.2.4AFP校準品制備用系列國家標準品標定AFP純品抗原后，用AFP校準品稀釋液稀釋成含量分別為0, 10, 25, 50, 15, 600 ng/mL系列濃度，用國家標準品做定量曲線進行校準品濃度測定、相關性分析,建立定量標準品.

　　1.2.5化學發光系統的優化［2-3］由SapphireII不同濃度的增強劑和CSPD組成底物工作液，進行化學發光值（RLU）測定，進行底物工作液的優化.

　　1.2.6固相化抗體微孔板的制備［4］將抗AFP單抗用0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)稀釋成1.0, 2.0, 5.0, 7.0, 10.0, 15.0 μg/mL的包被濃度，按100 μL/孔的量加入包被板中，37℃包被2 h，再用含10 g/L酪蛋白的0.01 mol/L PBS (pH 7.4)37℃封閉2 h后晾干備用，確定包被選擇最佳包被抗體工作濃度.
 
　　1.2.7正常人參考血清的確定用優化好的AFP化學發光定量試劑對800份健康人標本進行濃度測定，進行統計學分析，計算x+2 S，確定正常血清參考范圍.

　　1.2.8化學發光免疫檢測樣品或標準品于相應孔分別加25 μL后，每孔再各加抗AFPALP75 μL，在震蕩器上混勻1 min，置37℃恒溫反應60 min. 洗掉游離成分，加入底物工作液50 μL，ALP催化底物脫磷酸酯,并發出463 nm的可見光，第10 min后測定各加樣品孔的發光值RLU，并將數據用化學發光檢測儀定量軟件Luminoskan Ascent version 2.4.1軟件進行定量分析.

　　2結果

　　2.1底物工作液的優化CSPD濃度為0.8, 0.4, 0.2, 0.1 mmol/L，SapphireII濃度為2.0, 1.0, 0.5, 0.25 g/L，分別用堿性磷酸酶1∶1000, 1∶10000在5, 10 min進行化學發光測定，記錄不同增強劑和CSPD濃度的發光值，分別做出CSPD濃度RLU的曲線和SapphireIIRLU的曲線（圖1）.

　　分析上述數據可得出以下結論CSPD在0.4 mmol/L以下時，RLU隨CSPD濃度的變化而成比例變化，在0.4 mmol/L時達到平臺，可能是底物濃度在0.4 mmol/L時使酶達到飽和. 增強劑SapphireII濃度對RLU的變化較復雜，在0.5~1 g/L時達到最大RLU，以后隨著增強劑濃度的增加RLU反而下降. 確定底物工作液配制的濃度為：0.4 mmol/L的CSPD，增強劑SapphireII濃度為1.0 g/L.
 
　　2.2包被抗體濃度和酶標記抗體濃度的確定根據不同包被抗體濃度測定定量標準品的發光值，分別做出不同濃度包被抗體RLU的曲線（圖2）. 包被濃度低時試劑的整體發光值也低，隨著包被濃度的升高發光值也相應升高，在5.0 μg/mL時，發光值達到一個平臺期（此時靈敏度達到一個平臺期），選擇標準曲線接近于直線時的包被濃度（5 μg/mL）為最佳.

　　2.3最低檢出量平行測定20孔零值校準品血清，計算零值校準品RLU平均值（x）及標準差(S)，以x+2 S為測定值代入標準曲線方程中，求出其對應的濃度值，所對應的濃度值即為最低檢出量為2.0 ng/mL.
 
　　2.4特異性檢測分別測定與CEA(3 μg /mL)、鐵蛋白(10 μg /mL)、人血清蛋白(200 g/L)、人丙種球蛋白(200 g/L)的交叉反應率，分別為≤0.15%, ≤0.04%, ≤2.5×10-8, ≤1.03×10-8.

　　2.5精密度測定AFP濃度為48.8~73.2 ng/mL的質控血清，重復檢測3次,每次重復20孔，進行精密度測定，計算批內、批間平均變異系數分別為6.7%, 7.7%.

　　2.6正常人參考血清的確定對800份健康人血清檢測進行統計，其中有95.4%的小于8.0 ng/mL,正常濃度只有上限而無下限，上限濃度去除5%的不可信區間，同時參考放免檢測結果和目前公認的正常值范圍，本檢測方法的正常人血清應小于25 ng/mL.

　　2.7準確度取3份臨床樣本分別加入5 ng/mL, 20 ng/mL, 50 ng/mL濃度的血清樣品測試樣品的加入回收率，對3份臨床樣本分別進行90%, 60%, 30%稀釋計算稀釋回收率，結果顯示：加入平均回收率為98.6%，平均稀釋回收率為102.3%.

　　2.8與進口試劑的比較［5］與bayer ACS: 180 全自動化學發光系統的AFP試劑共同對100份臨床標本進行檢測，二者所得的數值進行分析，其相關性有統計學意義（圖3），LumiassayTM=1.2715×ACS: 180  -0.4126（n=100），（r=0.994, P<0.001）.

　　3討論

　　甲胎蛋白（AFP）為最常用的腫瘤標志物之一，其定量檢測的方法主要有放射免疫法、酶聯免疫法、時間分辨熒光免疫法和化學發光免疫法,各具特點.
   
　　本研究建立的甲胎蛋白(AFP)化學發光免疫定量分析方法［6］，采用自行設計AFP多抗血清制備和純化工藝，采用改良過碘酸鈉乙二醇法對AFP多抗進行ALP標記，較傳統的戊二醛交聯法標記效率要高，靈敏度、特異性都較好；采用金剛烷衍生物及其增強劑作為發光底物系統［7］, 其酶解速度快，達到最大光信號時間短，且發光信號強、持續時間長，信噪比高，通過優化增強劑的濃度能使發光強度增強100~100 000倍；可測定濃度線性范圍寬，樣品無需稀釋即可檢測. 由于化學發光具有熒光的特異性，同時不需要激發光，從而避免了熒光分析中激發光雜散光的影響，有很高的靈敏度，該方法最低檢出量為2.0 ng/mL. 該方法克服了傳統的放射免疫法帶來的環境污染和健康危害；操作簡單，檢測自動化程度高，適用于全自動和半自動儀器.
　　本研究建立的方法敏感性、特異性、線性范圍、精密度、回收率均能滿足常規臨床檢測要求，其采用的是開放式反應系統，因此可與大多數的化學發光檢測儀器配套使用，在臨床推廣應用.

【參考文獻】
  　　
    ［1］巴德年. 當代免疫學技術與應用［M］. 北京： 北京醫科大學中國協和醫科大學聯合出版社，1998:927-948.

　　［2］尹東光，賀佑豐，劉一兵,等. 幾種主要化學發光物質的發光性能及其化學發光免疫分析體系［J］.標記免疫分析與臨床,2002，9(4):225-229.

　　［3］賀艷峰，張家明，郭小英，等. 化學發光法檢測腫瘤標志物［J］.化學通報,2005,68:135-146.

　　［4］Lin J, Yan F, Ju H. Noncompetitive enzyme immunoassay for alphafetoprotein using flow injection chemiluminescence［J］. Appl Biochem Biotechnol, 2004,117(2):93-102.

　　［5］Josefina MB, Neus GR. Evaluation of Ciba Corning ACS: 180TM Automated Immunoassay System［J］.Clin Chem,1994，40(3):407-410.

　　［6］Lin J, Yan F, Hu X, et al. Chemiluminescent immunosensor for CA199 based on antigen immobilization on a crosslinked chitosan membrane［J］.Immunol Method, 2004,291(12):165-174.

　　［7］Dan Chen, Lawrence A. Kaplan. Performance of a newgeneration chemiluminescent assay for Hepatitis B surface antigen［J］. Clin Chem,2006, 52:1592-1598.