論文匯編血細(xì)胞分析儀是醫(yī)院臨床檢驗(yàn)應(yīng)用非常廣泛的儀器之一，是指對(duì)一定體積內(nèi)血細(xì)胞數(shù)量及異質(zhì)性進(jìn)行分析的儀器。20世紀(jì)9o年代以來(lái)，隨著電子技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)、激光技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)和新熒光化學(xué)物質(zhì)等各種高新技術(shù)在血細(xì)胞分析儀中的應(yīng)用.使血細(xì)胞分析儀的檢測(cè)原理不斷完善、測(cè)量參數(shù)不斷增加、檢測(cè)水平不斷提高.尤其在白細(xì)胞五分類(lèi)技術(shù)方面，已發(fā)展到利用多項(xiàng)技術(shù)(如射頻、細(xì)胞化學(xué)染色、流式細(xì)胞術(shù)和熒光染色技術(shù)等)聯(lián)合同時(shí)檢測(cè)一個(gè)白細(xì)胞.再用先進(jìn)的計(jì)算機(jī)技術(shù)區(qū)分、辨別經(jīng)上述方法處理后的各自細(xì)胞間的細(xì)胞差別.綜合分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得出較為準(zhǔn)確的白細(xì)胞分類(lèi)結(jié)果。為臨床疾病的診斷、治療提供了重要的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。近年來(lái)。可以對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行五分類(lèi)計(jì)數(shù)的血細(xì)胞分析儀已經(jīng)普遍使用。本文就目前血細(xì)胞五分類(lèi)測(cè)定中常用技術(shù)及其最新應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。
1 血細(xì)胞五分類(lèi)技術(shù)的原理
1.1 流式細(xì)胞術(shù)
流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)是一種綜合應(yīng)用光學(xué)、機(jī)械學(xué)、流體力學(xué)、電子計(jì)算機(jī)、細(xì)胞生物學(xué)、分子免疫學(xué)等學(xué)科技術(shù)，使被測(cè)溶液流經(jīng)測(cè)量區(qū)域，并逐一檢測(cè)其中每一個(gè)細(xì)胞的物理和化學(xué)特性，從而對(duì)高速流動(dòng)的細(xì)胞或亞細(xì)胞進(jìn)行快速定量測(cè)定和分析的方法。
首先，待測(cè)細(xì)胞經(jīng)處理或染色后被壓人流動(dòng)室，與此同時(shí)，不含細(xì)胞的緩沖液在高壓下從鞘液管?chē)姵觯室汗苋丝诜较蚺c待測(cè)樣品流成一定角度，這樣鞘液就能被包繞著樣品高速流動(dòng)，組成一個(gè)圓形的流束，待測(cè)細(xì)胞在包繞下單行排列，依次通過(guò)檢測(cè)區(qū)域.在激光束的照射下產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。這兩個(gè)光源信號(hào)分別反映了細(xì)胞體積的大小和內(nèi)部的信息.經(jīng)光電倍增管接收后可轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，再通過(guò)模，數(shù)轉(zhuǎn)換器.將連續(xù)的電信號(hào)轉(zhuǎn)換為可被計(jì)算機(jī)識(shí)別的數(shù)字信號(hào)，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理，可將分析結(jié)果顯示在屏幕上。
為了保證細(xì)胞單個(gè)排列地逐一通過(guò)檢測(cè)區(qū)域，鞘流技術(shù)在流式細(xì)胞術(shù)中被廣泛應(yīng)用。根據(jù)層流理論，由于兩種液體的流速和壓力不同。在一定條件下樣品溶液與包裹它的鞘液在流動(dòng)中可以保持相互分離并且同軸。同時(shí)鞘液流可以加速樣品溶液中顆粒的流動(dòng)并迫使他們的流動(dòng)軌跡保持在液流的中軸線上，使細(xì)胞單排列地逐一通過(guò)檢測(cè)區(qū)域，這便是所謂的液流聚焦原理
1_2 阻抗法
根據(jù)庫(kù)爾特原理，將不良導(dǎo)體血液按一定比例稀釋于等滲的電解液中，在小孔電極的兩側(cè)加一恒流源.在負(fù)壓作用下，使稀釋的血細(xì)胞通過(guò)小孔。當(dāng)細(xì)胞通過(guò)截面時(shí)會(huì)由于電阻增大產(chǎn)生相應(yīng)的脈沖，其脈沖的幅度與細(xì)胞的體積成正比，脈沖的頻度與細(xì)胞的數(shù)量成正比。這便是著名的庫(kù)爾特原理或稱變阻脈沖原理。利用庫(kù)爾特原理可以有效地區(qū)分淋巴及單核細(xì)胞。
1.3 激光散射法／多角度偏振光散射技術(shù)
根據(jù)光散射理論，當(dāng)激光照射到流動(dòng)室內(nèi)流過(guò)的每一個(gè)細(xì)胞時(shí)，由于細(xì)胞的物理特性，部分光線從細(xì)胞上經(jīng)不同的角度散射。其中，前向小角度散射光的光強(qiáng)可以反應(yīng)細(xì)胞體積；大角度散射光的光強(qiáng)可以反應(yīng)細(xì)胞核，漿復(fù)雜度和細(xì)胞顆粒的信息；而側(cè)向散射光的光強(qiáng)可以反應(yīng)細(xì)胞膜、核膜、細(xì)胞質(zhì)的變化。因此，可以依據(jù)細(xì)胞表明光散射的特點(diǎn)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)。用激光光源產(chǎn)生的單色光束直接進(jìn)入計(jì)數(shù)池的敏感區(qū)，在不同角度(10度～7O度)對(duì)每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行掃描分析，測(cè)定其散射光強(qiáng)度，從而提供細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)的光散射信息。由于粗顆粒細(xì)胞的散射強(qiáng)度比細(xì)顆粒細(xì)胞更強(qiáng)，故光散射對(duì)細(xì)胞顆粒的構(gòu)型和顆粒質(zhì)量具有很好的區(qū)別能力。
多角度偏振散射技術(shù)用偏振激光束射照單個(gè)排列細(xì)胞，并進(jìn)一步分辨細(xì)胞。該技術(shù)采用了l0度窄角和偏振加消偏振檢測(cè)法，分辨能力有所提高。它首先測(cè)試中性，單核細(xì)胞，用0度～90度的散射數(shù)據(jù)，再測(cè)得90度D的衍射差，將嗜酸性和中性細(xì)胞分開(kāi).而嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞則按其大小和內(nèi)部結(jié)構(gòu)不同的復(fù)雜性，所產(chǎn)生的散射光也各異，用可調(diào)較的門(mén)限加以區(qū)分。其采用特定程序自動(dòng)儲(chǔ)存分析數(shù)據(jù)，并經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件處理，在屏幕上顯示6個(gè)散點(diǎn)圖和2個(gè)直方圖。
1.4 各種細(xì)胞化學(xué)特性應(yīng)用技術(shù)
利用五種白細(xì)胞自身不同的化學(xué)性質(zhì).應(yīng)用相應(yīng)的化學(xué)試劑加以區(qū)分，由于嗜酸性(或嗜堿性)粒細(xì)胞均有較強(qiáng)的堿性(或酸性)，因此在特殊的溶血?jiǎng)┳饔孟拢?jīng)過(guò)特定時(shí)間及溫度的孵育，可使除嗜酸性(嗜堿性)粒細(xì)胞之外的所有細(xì)胞溶解或萎縮.經(jīng)處理之后的細(xì)胞根據(jù)阻抗脈沖計(jì)數(shù)法，可得相應(yīng)嗜酸性(嗜堿性)細(xì)胞有效數(shù)值。
利用五種白細(xì)胞過(guò)氧化物酶活性的差異對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行染色，測(cè)定其酶反應(yīng)強(qiáng)度，對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行分析。血液中五種白細(xì)胞的過(guò)氧化物酶活性排列順序?yàn)椋菏人嵝粤＜?xì)胞>中性粒細(xì)胞>單核細(xì)胞。淋巴細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞均無(wú)過(guò)氧化物酶。將待測(cè)血液加入清洗劑和甲醛的等滲液體內(nèi)經(jīng)孵育，再加入過(guò)氧化氫和四氯一萘酚，細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化酶分解產(chǎn)生氧離子，使四氯一萘酚顯色并沉淀，并定位于酶反應(yīng)部位。根據(jù)酶反應(yīng)強(qiáng)度的不同，利用光電檢測(cè)技術(shù)測(cè)定相應(yīng)吸光度值的方法,用以區(qū)分嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞。
1.5 電導(dǎo)，射頻法
與早期的三分類(lèi)血液分析儀利用庫(kù)爾特原理不同的是，它在內(nèi)外電極上加了一個(gè)RF射頻發(fā)生器。RF是射頻電流的簡(jiǎn)稱.它是一種高頻交流變化電磁波。按照工作頻率的不同，RF可以分為低頻(LF)、高頻(HF)、超高頻(UHF)和微波等不同種類(lèi).不同頻段的RF工作原理不同， 和HF頻段一般采用電磁耦合原理，而UHF及微波頻段的RF一般采用電磁反射原理。在血液分析儀中多采用高頻電磁波，其原理是交變電流通過(guò)導(dǎo)體時(shí)，會(huì)在導(dǎo)體周?chē)纬山蛔冸姶艌?chǎng)，形成電磁波。因?qū)w的密度及導(dǎo)電性質(zhì)等差異，其周?chē)纬傻碾姶艌?chǎng)也不相同。因此當(dāng)射頻電流穿透細(xì)胞膜透入胞內(nèi)時(shí)，由于核的大小、化學(xué)組分、顆粒多少以及漿核比例的不同，使RF信號(hào)發(fā)生不同的變化。借此可以將體積大小相同但內(nèi)部結(jié)構(gòu)不同的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)，如淋巴細(xì)胞與嗜堿性細(xì)胞。
1.6 熒光法
利用不同細(xì)胞的細(xì)胞膜、胞內(nèi)因子以及胞內(nèi)DNA、RNA、胞內(nèi)離子鈣等不同染色特性，選用具有特異性抗原或抗體的熒光染料載體，使待分離的細(xì)胞分別標(biāo)記相應(yīng)的熒光物質(zhì)，經(jīng)過(guò)特定波長(zhǎng)的激光照射激發(fā)出不同波長(zhǎng)的熒光，利用各種PMT管檢測(cè)熒光信號(hào)的個(gè)數(shù)，可以完成待檢細(xì)胞的計(jì)數(shù) 如進(jìn)一步分析計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞或網(wǎng)織紅細(xì)胞等
2 血細(xì)胞五分類(lèi)技術(shù)的應(yīng)用及展望
2.1 五分類(lèi)血液分析儀的現(xiàn)狀
全自動(dòng)五分類(lèi)血細(xì)胞分析儀是多學(xué)科相互交叉、滲透、綜合的產(chǎn)物，涉及技術(shù)領(lǐng)域包括電子技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、傳感器技術(shù)、信號(hào)處理技術(shù)、生物化學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、精密機(jī)械、光學(xué)、自動(dòng)控制、流體力學(xué)等領(lǐng)域。絕大多數(shù)“五分類(lèi)”分析儀采用了流式細(xì)胞分析方法，而聯(lián)合檢測(cè)法則代表了五分類(lèi)血細(xì)胞分析儀的最新發(fā)展趨勢(shì)。
BECKMAN COULTRER GENS全自動(dòng)五分類(lèi)血球分析儀采用其獨(dú)特的VCS技術(shù)，其中V(體積法)用于分析細(xì)胞體積；C(電導(dǎo)法)用于分析細(xì)胞核型；S(散射法)則用于分析細(xì)胞的顆粒特性。測(cè)試時(shí)。患者標(biāo)本經(jīng)過(guò)分血片等樣本分配系統(tǒng)進(jìn)入攪拌杯中，再加入溶血?jiǎng)嚢?溶血.完全破壞紅細(xì)胞，剩下的白細(xì)胞在樣本壓力作用下進(jìn)入流式通道。運(yùn)用VCS聯(lián)合檢測(cè)方法，在流式通道的某一位點(diǎn)。對(duì)通過(guò)的單列白細(xì)胞，進(jìn)行逐個(gè)的、同時(shí)的、三重的檢測(cè)以及三維分析，以確定其亞群性質(zhì)。
雅培公司新推出的CELL-DYN Ruby全自動(dòng)血液分析儀運(yùn)用合并流式細(xì)胞術(shù)及多角度偏振散射分離技術(shù)檢測(cè)白細(xì)胞。其采用多角度偏振散射技術(shù)對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分和按序分離，通過(guò)四個(gè)角度的光學(xué)檢測(cè)進(jìn)行白細(xì)胞分析。其中，0度用于區(qū)分細(xì)胞體積大小；10度用于區(qū)分細(xì)胞的復(fù)雜性；90度用于區(qū)分細(xì)胞核的分葉性；90度D用于區(qū)分細(xì)胞的顆粒性。通過(guò)90度偏振和90度去偏振區(qū)分嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞， 同時(shí)通過(guò)多個(gè)散點(diǎn)圖分析來(lái)鑒別和分類(lèi)未成熟細(xì)胞和干擾物質(zhì)。
拜爾公司的ADV IA120利用化學(xué)特性中過(guò)氧化物酶活性與激光散射技術(shù)結(jié)合原理進(jìn)行白細(xì)胞五分類(lèi)測(cè)定。該儀器有4個(gè)測(cè)量通道：血紅蛋白測(cè)量通道、紅細(xì)胞／血小板測(cè)量通道、嗜堿性粒細(xì)胞測(cè)量通道、過(guò)氧化物酶測(cè)量(白細(xì)胞分類(lèi))通道。其利用五種白細(xì)胞過(guò)氧化物酶活性的差異對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行染色.測(cè)定其酶反應(yīng)強(qiáng)度，對(duì)自細(xì)胞進(jìn)行分析。在測(cè)試過(guò)程中.每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生2個(gè)信號(hào)：組化染色結(jié)果與光散射結(jié)果。以X軸代表吸光率(組化染色酶反應(yīng)強(qiáng)度)，Y 軸代表光散射(細(xì)胞大小)，一起定位于細(xì)胞圖上(cytogram)。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)存儲(chǔ)資料進(jìn)行分析處理，并結(jié)合嗜堿性或分葉細(xì)胞通道結(jié)果計(jì)算出白細(xì)胞總數(shù)及分類(lèi)。值得一提的是，該設(shè)備對(duì)RBC及PLT的測(cè)定也摒棄了傳統(tǒng)的阻抗法，而是采用激光法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定的。
希森美康(SYSMEX)公司五分類(lèi)血液分析儀的檢測(cè)原理按生產(chǎn)時(shí)間的先后可分為三大類(lèi)：多通道阻抗與射頻聯(lián)合檢測(cè)技術(shù).代表機(jī)型有SE一9000；激光流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)合細(xì)胞組化染色技術(shù)，代表機(jī)型有SF一3000；激光流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)合核酸熒光染色技術(shù)，代表機(jī)型有SF一2l00。
SYSMEX XE一2100全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀是綜合了前向散光、側(cè)向散光和側(cè)向熒光三種光學(xué)檢查技術(shù)，結(jié)合電阻抗技術(shù)來(lái)進(jìn)行白細(xì)胞分類(lèi)的。直流電阻抗法(DC)用于測(cè)量細(xì)胞體積大小。激光散射產(chǎn)生的前向散射光、側(cè)向散射光可用于探測(cè)白細(xì)胞體積大小、細(xì)胞內(nèi)含物的情況(細(xì)胞核以及顆粒情況)，側(cè)向熒光則可以反映細(xì)胞內(nèi)脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的含量。綜合各個(gè)測(cè)量方法，得到白細(xì)胞五分類(lèi)的圖形和數(shù)據(jù)。SYSMEX XT一2000i全自動(dòng)血液分析儀運(yùn)用核酸熒光染色技術(shù)，配合激光流式分析系統(tǒng)，保證了精確的WBC五項(xiàng)分類(lèi)結(jié)果。
HORIBA ABX 公司生產(chǎn)的Pentra系列五分類(lèi)血液分析儀采用獨(dú)有的雙鞘流通道，結(jié)合阻抗法、化學(xué)染色技術(shù)及吸光度法對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行精確的分析。流式通道內(nèi)有兩個(gè)檢測(cè)裝置，60um的鞘流微孔用于阻抗法體積檢測(cè)，42um 的光窗用于吸光度測(cè)定分析細(xì)胞內(nèi)容物。實(shí)現(xiàn)對(duì)大量細(xì)胞進(jìn)行的順序、快速、準(zhǔn)確地分析與測(cè)定。
以上所介紹的幾種血液分析儀是目前我國(guó)醫(yī)療機(jī)構(gòu)常見(jiàn)的具有代表性的幾種測(cè)定白細(xì)胞五分類(lèi)的機(jī)型。另外，日本光電公司生產(chǎn)的MEK一8222K在中國(guó)的擁有量也較大.因其工作原理與雅培公司的CELL—DYN Ruby相似.也是采用半導(dǎo)體激光法和多角度激光散射技術(shù)，只是試劑的配方有所區(qū)別，因此不再贅述。
國(guó)內(nèi)邁瑞公司生產(chǎn)的BC一5500的白細(xì)胞分類(lèi)結(jié)合了液流聚焦技術(shù)、激光散射技術(shù)和化學(xué)染色技術(shù)。其光源采用半導(dǎo)體激光系統(tǒng)，通過(guò)多角度的激光散射，提供細(xì)胞的大小、細(xì)胞核、細(xì)胞顆粒大小及復(fù)雜性的信息.并結(jié)合試劑對(duì)嗜酸性細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞的特異處理，將嗜酸性細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)，剛篩選出各類(lèi)異毒細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)精確的五分類(lèi)檢測(cè)結(jié)果。
由于不同儀器的檢測(cè)原理及相關(guān)試劑的差異，各類(lèi)設(shè)備均有其相應(yīng)的特點(diǎn)。總體來(lái)講，光學(xué)檢測(cè)法結(jié)合特種化學(xué)試劑如染色物質(zhì)等.由于其針對(duì)某一被檢物質(zhì)的特異性，因此其測(cè)定及分析結(jié)果較電阻法精確度要高，但相應(yīng)的試劑成本加大，同時(shí)對(duì)操作人員及環(huán)境的要求也會(huì)有所提高。
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