論文匯編分子生物學技術在臨床檢驗診斷中的應用
日期:2010-06-04 13:52:56 來源:中華檢驗醫學網
現代分子生物學是研究生物大分子--核酸及其表達產物蛋白質的結構、功能、遺傳、調控、相互關系和相互作用，從分子水平上探討生命現象的科學，其主要研究對象是核酸（DNA和RNA）和蛋白質。自從1953年Watson和Crick發現DNA的雙螺旋結構以來，分子生物學在短短五十年時間里以超乎想象的速度飛速發展，滲透到醫學每一個領域。可以毫不夸張的說，如果沒有分子生物學的應用，人類探索生命活動的行為將會寸步難行。
將分子生物學技術應用到臨床檢驗診斷學，使疾病診斷深入到基因水平，稱為基因診斷。基因診斷技術主要包括核酸分子雜交技術、聚合酶鏈式反應（PCR）技術、基因多態性分析技術、單鏈構象多態性（SSCP）分析技術、熒光原位雜交染色體分析（FISH）技術、波譜核型分析（SKY）技術、DNA測序技術、基因芯片技術以及蛋白質組技術等，一些先進的分離和檢測技術大大促進了上述技術的完善和發展，如毛細管電泳技術（CE）、液質聯用技術（LC/MS/MS）、變性高效液相色譜技術（DHPLC）、非熒光遺傳標記分析技術等。基因診斷在感染性疾病、遺傳性疾病、腫瘤性疾病等的診斷中發揮越來越重要的作用。下面，我們就臨床檢驗診斷中涉及的主要分子生物學技術作一簡要介紹。
1．核酸分子雜交技術
即基因探針技術。利用核酸的變性、復性和堿基互補配對的原理，用已知的探針序列檢測樣本中是否含有與之配對的核苷酸序列的技術。是臨床應用最早的，也是最基礎的分子生物學技術，是印跡雜交、基因芯片等技術的基礎。不少探針已經商品化。
2．PCR技術
PCR技術是一種特異擴增DNA的體外酶促反應，可以短時間擴增出兩段已知序列之間的DNA，用于診斷、鑒定、制備探針及基因工程產品開發等，是一項及其有效和實用的技術。由于PCR試驗存在一定的假陽性和假陰性問題，導致PCR技術在我國臨床診斷中的應用曾一度被叫停，近年來由于改進的PCR技術如巢式PCR（nested PCR）、多重PCR(multiplex PCR) 、熒光PCR技術等在較大程度上增加了該技術的敏感性和特異性，加上衛生部于 2002-01頒發了有關基因擴增檢驗技術臨床應用的法規性文件《臨床基因擴增檢驗試驗室管理暫行辦法》(衛醫發〔2002〕10號 )，要求從事臨床基因擴增檢驗的技術人員必須經過衛生部臨床檢驗中心或授權的省級培訓機構的上崗培訓，持證上崗，使PCR技術在臨床檢驗診斷中重新發揮其不可替代的作用，PCR已廣泛用于核酸的科學研究以及臨床疾病的診斷和治療監測，尤其在感染性疾病診斷方面更有應用價值。
3．基因多態性分析技術
在人群中，各個體基因的核苷酸序列會存在一定差異，稱為基因多態性。基因多態性位點普遍存在于人的基因組中，并按孟德爾遺傳方式遺傳。如果在某個家庭中，某一致病基因與特定的多態性片段緊密連鎖，就可以用這一多態性片段作為一種“遺傳標記”來判斷家庭成員或胎兒是否攜帶有致病基因。目前認為基因多態性是個體的“身份證”；有的雖然不表現疾病，但也許會影響對藥物的反應和用藥效果。因此，基因多態性分析技術已經廣泛應用于群體遺傳學研究、疾病連鎖分析和關聯分析、疾病遺傳機制研究、腫瘤易感性研究、個性化用藥等諸多方面。遺傳學上把基因多態性片段稱為遺傳標記。遺傳標記分析經歷第一代限制性酶切片段多態性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、第二代微衛星DNA(Microsatellite DNA)，現已發展到第三代單核苷酸多態性分析(single nucleotide polymorphism, SNP)。下面分別介紹如下：
3.1限制性酶切片段多態性(RFLP)分析技術
RFLP是利用限制性內切酶在特定的核苷酸序列切割雙鏈DNA后凝膠電泳分離開不同大小片段，由于不同個體存在核苷酸序列差異導致限制性酶切位點變化從而使酶切片段呈現多態現象。傳統的RFLP方法是指基因組DNA經限制性內切酶酶切，電泳分離后再結合Southern 印跡雜交，構建出DNA指紋圖，這種方法特異性和敏感性均較高，但操作繁雜。目前結合PCR技術產生PCR-RFLP方法，是檢測與特定的酶切位點有關的突變的簡便方法。RFLP方法在遺傳性疾病診斷、微生物種屬分型、腫瘤發病及診斷研究等領域應用廣泛。
3.2 微衛星DNA分析技術
微衛星DNA(Microsatellite DNA)，又稱為短小串聯重復(Short tandem repeats, STR)或簡單重復序列 (Simple repeat sequence, SRS或SSR) ，廣泛存在于原核生物和真核生物基因組中，常見的有二、三、四核苷酸重復序列，約占真核生物基因組的 5%，其基本構成單元 (核心序列 )為 1 – 6bp。其中最為常見的是雙核苷酸重復即 (CA)n和 (TG)n，人類基因組約有5×104～1×105個 (CA)ｎ重復序列，占 10 %。每個微衛星DNA的核心序列結構相同，重復單位數目約為 10～60次，其長度一般不超過 300bp，多位于基因非編碼區、內含子或非翻譯區，可存在于Ａlu序列中或衛星序列中，但在編碼序列及外顯子中也可找到。微衛星DNA的高度多態性主要來源于串聯數目的不同。關于微衛星DNA多態性產生的機制，目前普遍認為是DNA復制過程中滑動或DNA復制和修復時鏈滑動與互補鏈堿基錯配，導致一個或幾個重復單位的缺失或插入。
微衛星DNA是近年來飛速發展起來的一種新型的DNA高度多態性遺傳標記系統，具有種類多分布廣泛、高度多態性、雜合性高、重組率低的特點，在群體中變異范圍大，構成了豐富的長度多態性，有高度的個體特異性，并遵循孟德爾共顯性遺傳規律，提供了眾多有高度遺傳信息的新的多態性標記。這種多態性標記已廣泛用于構建人類遺傳圖譜、法醫學親子鑒定、遺傳疾病和腫瘤發生機制的研究、疾病相關基因、疾病連鎖基因和易感基因的研究、以及疾病診斷等等。
3.3單核苷酸多態性分析(SNP)技術
隨著基因組測序工作的進展，日益發現基因組中存在著數量龐大的 SNP。SNP是一種最常見的可遺傳變異，在人類DNA多態性中，SNP約占 90 %。 SNP是指在基因組內特定核苷酸位置上存在兩種不同的堿基，其中最少一種在群體中的頻率不小于1 %。 SNP分為兩種形式，一是基因編碼區的 SNP，稱為 cSNP；二是遍布于基因組的大量單堿基變異。SNP作為一種堿基的替換，大多數為轉換，即一種嘌呤換為另一種嘌呤或一種嘧啶換為另一種嘧啶，轉換與顛換之比為 2∶1。研究發現，SNP在人類基因組 CpG序列上出現最頻繁，約占全部SNP的25%，而且多為 C→T，原因在于CpG中胞嘧啶殘基 (C)是甲基化的，能夠自發地脫氨基產生胸腺嘧啶 (T)。因此，SNP與 RFL P和 STR等 DNA標記的主要不同在于：它不再以“長度”的差異作為檢測手段，而是直接以序列的差異作為標記。但 SNP單個基因座的多態性很差，只有二態，為此采用多個SNP基因座進行“單倍型” 分析尤顯重要。與第 1、2代遺傳標記相比，SNP分析具有以下特點：(1 )SNP數量大，分布密集，平均每 1000bp就有1個 SNP。在 PKD基因內部或附近可能會找到許多 SNP，聯合用于ADPKD的單倍型診斷；(2 ) SNP比STR擴增更可靠，不會產生假帶；(3 )由于 SNP是二態的，易于自動化批量檢測，易于計算機分析結果。
SNP的研究已受到廣泛的重視，它已成為實驗室和公司爭奪的對象，也是人類基因組計劃中的一個重要補充和研究熱點。用于 RFLP、STR的技術方法，理論上均可用于 SNP的識別和檢出。但印跡分析和 PCR方法，如 SSCP、DGGE等，大都需要標記和電泳，費時費力，難于自動化。近年來，采用了微陣列 DNA芯片、飛行質譜分析和變性高效液相層析法等非電泳分型技術，大大加快了SNP檢測效率。
SNP檢測已廣泛地應用于疾病的連鎖分析及關聯分析、腫瘤的雜合性缺失研究、疾病遺傳機制研究、個性化用藥研究等諸多領域。盡管沒有人懷疑SNP在搜尋疾病基因方面的價值，但事實卻比人們想象的要難得多。首先基因中存在著的重組破壞了SNP和增加疾病風險性的變異之間的聯系，使得相關分析變得困難。有研究指出關聯分析比典型的家系分析需要的樣本要多得多，以便篩除錯誤的信號。因此只有高速率分析數千個DNA樣本的新技術的出現才會使SNP分析變得真正有價值；其次，雖然關聯分析對于只有一個基因位點上的缺陷等位基因的鑒定有實用意義，但這種情況又不常見，大約 90 %疾病易感基因有 1 0個以上相關突變存在，而癌癥及其它一些疾病則常涉及多個基因。另外，最普遍的SNP也是最古老的，他們可以同時存在于正常人或患者中，這就意味著SNP和基因的關鍵突變之間的特定聯系可能不存在一個特殊的模式，人們很容易錯失一個很重要的聯系，或者作出一個錯誤的聯系。樣本數量也是SNP應用的一個障礙。盡管大部分SNP出現在各種群體中，但是某一種SNP可能只出現在一個亞群中，一些有意義的cSNP也以相當高的比例出現在某一亞群中。所以要搜尋SNP就要盡可能地采用多種多樣的大樣本。專利問題也限制著SNP技術應用。由于SNP具有的新穎性、實用性和不明確性等特征，使得許多商業公司搶先獲得SNP后能夠對其申請專利，限制了許多研究者對它們的使用。
4．單鏈構象多態性分析(SSCP)技術
SSCP是一種簡便快速的檢測DNA或cDNA突變的技術。其技術原理和過程是：將PCR擴增到的待測DNA或cDNA片段變性，成為單鏈DNA，在一定條件下，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將單鏈DNA變性。由于單鏈DNA的空間構象與分子內堿基組成密切相關，一個堿基的差異即可形成不同的構象，不同構象的DNA在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的泳動速率不同，形成的帶型則不同，故能反映出單鏈DNA片段的多態性。
5．DNA測序技術
將待測DNA片段轉變成一系列放射性核素標記的單鏈寡核苷酸，并使其一端為一固定的末端。另一端由于長度不同，成為一系列相差一個堿基的連續末端。在分別含有4種脫氧核酸的反應體系中，寡核苷酸分別終止于不同位置的A、T、G或C堿基。將4種反應體系的寡核苷酸產物，在變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中上樣于相鄰的加樣孔進行電泳分離。由于全部可能產生的不同大小寡聚核苷酸都存在于4種反應產物中，從放射自顯影后的4種末端寡聚核苷酸梯子形圖譜中，就可以直接讀出DNA序列。
DNA測序技術使直接檢測核苷酸突變成為可能，而不僅僅是基因片段的多態性分析，使臨床基因診斷更加精確。常用于探針設計、特異引物合成、基因結構分析等，在遺傳病診斷、微生物種屬鑒定、腫瘤診斷等領域廣泛應用，人類基因組計劃就是由于大規模自動化測序技術的發展而順利完成的。但由于DNA測序方法復雜，一般臨床實驗室無法進行，有必要時可委托有條件的公司或研究機構進行。
6．DNA芯片技術
DNA芯片技術，實際上就是一種大規模集成的固相雜交，是指在固相支持物上原位合成(in situ synthesis)寡核苷酸或者直接將大量預先制備的DNA探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后與標記的樣品雜交。通過對雜交信號的檢測分析，得出樣品的遺傳信息(基因序列及表達的信息)。由于常用計算機硅芯片作為固相支持物，所以稱為DNA芯片。根據芯片的制備方式可以將其分為兩大類：原位合成芯片和DNA微集陣列(DNA microarray)。芯片上固定的探針除了DNA，也可以是cDNA、寡核苷酸或來自基因組的基因片段，且這些探針固化于芯片上形成基因探針陣列。因此，DNA芯片又被稱為基因芯片、 cDNA芯片、寡核苷酸陣列等。
作為新一代基因診斷技術，DNA芯片的突出特點在于快速、高效、敏感、經濟，平行化、自動化等，與傳統基因診斷技術相比，DNA芯片技術具有明顯的優勢：①基因診斷的速度顯著加快，一般可于30 min內完成。若采用控制電場的方式，雜交時間可縮至1 min甚至數秒鐘。②檢測效率高，每次可同時檢測成百上千個基因序列，使檢測過程平行化。③基因診斷的成本降低。④芯片的自動化程度顯著提高，通過顯微加工技術，將核酸樣品的分離、擴增、標記及雜交檢測等過程顯微安排在同一塊芯片內部，構建成縮微芯片實驗室。⑤因為是全封閉，避免了交叉感染；且通過控制分子雜交的嚴謹度，使基因診斷的假陽性率、假陰性率顯著降低。
DNA芯片技術在腫瘤基因表達譜差異研究、基因突變、基因測序、基因多態性分析、微生物篩選鑒定、遺傳病產前診斷等方面應用廣泛。如感染性疾病是由于病原微生物(病毒、細菌、寄生蟲等)侵入機體而引起。目前已經獲得一些生物的全部基因序列，包括141種病毒，幾種細菌(流感嗜血桿菌、產甲烷球菌、支原體M.genitalium及實驗室常用的大腸桿菌等)和一種真核生物(釀酒酵母)，且數量還在增長。因此，將一種或幾種病原微生物的全部或部分特異的保守序列集成在一塊芯片上，可快速、簡便地檢測出病原體，從而對疾病作出診斷及鑒別診斷。用DNA芯片技術可以快速、簡便地搜尋和分析DNA多態性，極大地推動法醫生物學的發展。比如將個體SNPs設計在一塊DNA芯片上，與樣品DNA雜交，即可鑒定基因的差異。人的體型、長相約與500多個基因相關，應用DNA芯片原則上可以揭示人的外貌特征、臉型、長相等，這比一般意義的DNA指紋譜又進了一步。 應用DNA芯片還可以在胚胎早期對胎兒進行遺傳病相關基因的監測及產前診斷，為人口優生提供有力保證；而且可以全面監測200多個與環境影響相關的基因，這對生態、環境控制及人口健康有著重要意義。
7．蛋白質組及分析技術
隨著大量生物體全基因組序列的獲得，特別是人類基因組序列草圖的完成，基因組學研究重點不可避免地從結構基因組學轉向功能基因組學，而蛋白質組學（proteom）正是作為功能基因組研究的重要支柱在上世紀90年代中期應運而生。蛋白質組是指一個基因，一個細胞或組織所表達的全部蛋白質成分。蛋白質組學研究的是在不同時間和空間發揮功能的特定蛋白質群體，從而揭示和說明生命活動的基本規律。蛋白質組學可以分為三個領域：①蛋白質的大規模的分離與鑒定，以及它們的表達后修飾；②蛋白水平的差異顯示在疾病中的運用；③運用當前的一切手段研究蛋白質與蛋白質之間的相互關系。與基因組相比蛋白質組具有多樣性和可變性。對一個機體而言，基因的數目是恒定的，而蛋白質的種類和數目在同一個機體的不同細胞中各不相同，即使同一細胞在不同的時期，不同條件下，其蛋白質表達也不同。雖然可以通過cDNA芯片等方法顯示生物體的基因啟動狀況，但mRNA水平 (包括mRNA的種類和含量 )并不能完全反映出蛋白質的表達。另外從研究手段方面來說，蛋白質研究技術比基因技術相對要復雜和困難，不僅氨基酸殘基數量多于核甘酸殘基，而且在蛋白質組研究中沒有一種方法象PCR那樣能迅速擴增目的片段，這樣對于豐度低但功能重要的蛋白質很難進行大規模的研究。
目前，蛋白質組學研究的主要技術包括：雙向（二維）聚丙烯酰胺凝膠電泳（結合等電聚焦和IEJK）分離蛋白質，在固相載體上形成蛋白質-多肽圖譜，用敏感的方法染色（如銀染）并用圖像分析電子計算機進行鑒定；將蛋白質點切下，用酶消化，進一步用氨基酸分析、質譜分析等進行鑒定；或結合蛋白質的毛細管電泳，高效液相色譜技術（HPLC）以至蛋白質芯片進行鑒定。
蛋白質芯片 (protein array)是近年來蛋白質組學研究中興起的一種新的方法，它類似于基因芯片，是將蛋白質點到固相物質上，然后與要檢測的組織或細胞等進行“雜交”，再通過自動化儀器分析得出結果。這里所指的“雜交”是指蛋白與蛋白之間如 (抗體與抗原 )在空間構象上能特異性的相互識別。此方法與傳統的研究方法相比具有如下優點：①蛋白質芯片是一種高通量的研究方法，能在一次實驗中提供相當大的信息量，使我們能夠全面、準確的研究蛋白表達譜，這是傳統的蛋白研究方法無法做到的。②蛋白質組芯片的靈敏度高，它可以檢測出蛋白樣品中微量蛋白的存在，檢測水平已達ng級。美國科學家Haab等運用綠色熒光 (green fluorescence)標記抗體微陣列，用紅色熒光 (red fluorecence)標記蛋白混和物，并運用計算機識別 (R/G)的信號強弱，來進行檢測，檢測水平可達到 1ng/ml。③蛋白質芯片具有高度的準確性。
蛋白質組芯片可用于蛋白質組學研究中的各個領域，具體來說大致可分為三個方面：研究蛋白質與蛋白質之間的相互作用，篩選新的蛋白質；蛋白質芯片能夠用于現在其它方法不能檢測到的，如蛋白質-藥物、蛋白質-脂質之間的相互作用；蛋白質組芯片還可用于檢測蛋白與小分子物質的作用。例如蛋白質與DNA ，RNA分子等。蛋白質芯片的制作是決定其運用的關鍵因素之一，蛋白質組芯片的制作比當前流行DNA芯片制作要復雜，特別是涉及大量不同種類的蛋白的高效表達與純化。因此，蛋白質芯片制作存在費時、費力且成本較高等不足，限制了其在臨床的應用。
8．熒光原位雜交染色體分析技術（FISH）
FISH是上世紀80年代中期發展起來并直到現在仍在不斷改進、完善的技術。其基本過程是：首先制成染色體標本，和與所感興趣的目的基因（或染色體片段）互補的探針，并在探針上標記熒光色素，當探針與染色體標本上的靶序列雜交后，利用熒光顯微鏡觀察熒光信號從而獲得染色體核型的信息。此技術具有靈敏度強、背景低、快速等優點，避免了使用穩定性差、暴光時間長、易污染環境的放射性核素，成為細胞遺傳學與分子生物學之間溝通的橋梁。這項實用技術不僅可用于基因在染色體上的定位研究，而且可直接用于實驗室診斷。例如，應用bcr-abl基因探針進行FISH染色體分析診斷慢性髓系白血病。
近年來FISH技術不斷發展，產生了染色體原位抑制（CISS）技術、間期核FISH、引物原位標記或DNA合成（PRINS）技術等，并且發展出多色FISH和多重FISH技術廣泛應用于染色體數目和結構畸變及斷裂點檢測，標志染色體的識別，多個不同基因的染色體定位，物理圖譜的制作，基因缺失和擴增的檢測等，在腫瘤細胞遺傳學分析中發揮了重要作用。
9．波譜核型分析技術（Spectral karyotyping, SKY）
傳統FISH技術采用的熒光顯微術基于熒光色素特異性的光學濾鏡進行單強度的熒光檢測，因此很難同時獲得多個信號用于分析。1996年，Schrock等將傅立葉光譜學、CCD成像技術和光學顯微術結合起來，建立了SKY技術，可以在可見光和近紅外區的所有位置同時檢測樣品的發射光譜，從而可利用發射光譜內所有信息進行分析。目前SKY技術可以補充染色體常規顯帶分析的不足，清楚地說明G顯帶不能解釋的復雜染色體畸變，主要用于腫瘤細胞的遺傳學分析，檢測復雜的細胞遺傳學異常，也可用于比較細胞遺傳學的種間進化差異性研究等方面。
10．分子生物學相關技術的發展及作用
10.1 毛細管電泳技術（capillary electrophoresis, CE）
CE是一項迅速發展的分離技術，主要用于生物大分子的分離，如DNA和被十二烷基磺酸鈉 (SDS)飽和的蛋白質，是在一根內徑25～100μm毛細管內進行的，毛細管中充入交聯聚合物，聚合物起到了分子篩的作用，使質量電荷比相同的物質能夠按照分子由小到大的順序流出，從而實現了分離。分辨率高于高效液相色譜，進樣量只需 1～50nl，在毛細管上開一檢測窗口，直接進行柱上檢測，靈敏度較高，而且樣品前處理非常簡便，適用于大量臨床樣品的分析。CE有多種分離模式，其中毛細管凝膠電泳已越來越廣泛地用于基因診斷、基因治療等臨床分子生物學領域。
毛細管凝膠電泳與傳統的板式或管式凝膠電泳相比，具有以下特點：(1 )分辨率高，因為毛細管電泳可以施加比板式電泳高 10～100倍的場強，毛細管本身已經具有抗對流作用，不必再使用具有抗對流性的凝膠：(2 )分析速度快；(3 )定量更加準確，避免了電泳染色時因時間、溫度、染色劑濃度和放置時間不同而產生的誤差；(4)靈敏度更高，毛細管電泳為柱上檢測，如使用激光誘導熒光檢測器，檢測限可以提高到10-18到10 –21mol/L；(5)實現自動化操作。能夠進行制備性分離是板式凝膠電泳的優點，目前毛細管電泳使用大孔徑毛細管和低場強，只可以進行少量制備，這項技術更適合于臨床實驗室高靈敏度快速分析的要求。
應用CE對PCR產物進行分析可以克服常規瓊脂糖電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳等方法分析速度慢、操作繁瑣、定量結果誤差大、自動化程度低的缺點，現已廣泛應用于病原體、腫瘤和遺傳病的基因診斷，如病原體特異基因檢測、基因突變檢測、DNA序列分析等。
10.2 液質聯用技術（LC/MS/MS）
在分析儀器行業中，質譜儀（mass spectrometer, MS）是靈敏度最高，對未知化合物的結構分析及定性最準確，要求相應標準樣品或對測定化合物的了解最少的定性手段。而高效液相色譜（HPLC）則是分離化合物范圍最廣、準確度高、對化合物破壞性小的快速分離方法，特別適用于生物提取物的分離。隨著電噴霧界面核大氣壓化學電離界面這兩個技術成熟后，HPLC和MS/MS技術才實現成功聯用，LC/MS/MS才實現飛速發展，成為科研和臨床分析的有力工具。
將LC/MS/MS應用于基因遺傳性代謝紊亂疾病的診斷，可在2分鐘內通過檢測血液中氨基酸或酰基肉堿水平異常可快速篩選出近30種基因遺傳性代謝紊亂疾病，如各種氨基酸代謝失常血癥包括胱氨酸尿癥、瓜氨酸血癥、酪氨酸血癥、超苯丙氨酸血癥、精氨酸缺乏癥、精氨琥珀酸尿癥和各種超甲硫氨酸血癥；短鏈核長鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥、異戊酸血癥、丙酸血癥、甲基丙二酸血癥、戊二酸血癥和其他各種有機酸代謝失常疾病等。另外，LC/MS/MS在多肽、激素、寡核苷酸以及藥物成分分析等方面應用廣泛。
10.3 變性高效液相色譜技術（DHPLC）
變性高效液相色譜 (denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)是一項在單鏈構象多態性 (SSCP)和變性梯度凝膠電泳 (DGGE)基礎上發展起來的新的雜合雙鏈突變檢測技術，可自動檢測單堿基替代及小片段核苷酸的插入或缺失。DHPLC檢測變異的基本原理：將工作溫度 (柱溫 )升高使DNA片段開始變性，部分變性的DNA可被較低濃度的乙腈洗脫下來。由于異源雙鏈 (錯配的 ) DNA與同源雙鏈DNA的解鏈特征不同，在相同的部分變性條件下，異源雙鏈因有錯配區的存在而更易變性，被色譜柱保留時間短于同源雙鏈，故先被洗脫下來，從而在色譜圖中表現為雙峰或多峰的洗脫曲線。這一技術最先由Oefner于 1 995年建立，目前全球使用最多也最易操作的是美國transgenomic公司開發的WAVE 核苷酸片段分析系統，它通過一個獨特的DNA色譜柱—DNA Sep柱進行核酸片段的分離和分析。
方法學比較研究表明，DHPLC敏感性和特異性可達 96%～100 %，明顯高于常用的DGGE、CCM、CSGE、SSCP等變異檢測技術。目前只有基于毛細管電泳技術發展起來的熒光單鏈構像多態性分析(F-SSCP)在敏感性和特異性方面能與DHPLC相媲美。但PCR引物的設計、PCR方法及條件、分離溫度及分離梯度等關鍵因素也影響DHPLC檢測敏感性。目前，該技術在基因突變檢測、DNA微衛星鑒定、腫瘤雜合性缺失的檢測、RT-PCR的競爭性定量、基因作圖、細菌鑒定、DNA片段大小測定及寡核苷酸的分析和純化等許多基因組研究領域中應用廣泛，最近已被進一步應用到mRNA的檢測，鑒定差異表達的基因。
10.3 非熒光標記的遺傳標記分析技術
近年來，美國GENTEON公司采用激光致導的動態熒光檢測技術（Dynamic fluorescence），結合多通道毛細管電泳技術，研制出Capella 400型全自動基因分析系統。該儀器采用動態熒光檢測技術，徹底消除了傳統熒光DNA標記檢測的高成本和復雜性，可精確有效到檢測未經標記的單鏈或雙鏈核苷酸。Capella 400系統是全球迄今為止首創的第一臺全自動384道毛細管電泳儀，該系統采用專利化學品與一個具有精密光學結構的旋轉圓柱狀毛細管陣列相組合，同一系統可進行多種核酸的高通量分析，可應用于SNP、STR、RFLP/AFLP分析，寡聚核苷酸片段質量控制分析、PCR產物質量控制分析、基因表達分析、DNA測序等。
11. 分子生物學技術在臨床檢驗診斷應用中的問題與展望
21世紀是生命科學的世紀，分子生物學技術為人類探索生命奧秘提供了強有力的工具，大量新理論、新技術不斷涌現，推動分子生物學蓬勃發展。由于一些新技術本身還不成熟、方法相對復雜、操作成本相對較高，限制了其在臨床檢驗的常規應用。但從長遠來看，隨著技術和經濟的不斷發展，分子生物學技術將以其不可比擬的強大功能逐漸成為臨床檢驗診斷的主要手段，因此，作為檢驗工作者應該積極學習分子生物學知識，掌握基本理論和基本技能，以便將來能勝任檢驗臨床工作。
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