論文匯編臨床肝膽腫瘤診斷主要分子標(biāo)志物
中國(guó)是一個(gè)肝癌大國(guó)，國(guó)家癌癥中心發(fā)布的最新數(shù)據(jù)顯示每年新發(fā)肝癌患者約36.5萬(wàn)。原發(fā)性肝癌發(fā)病率高、死亡率高，預(yù)后差，手術(shù)切除率低，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，尤其是進(jìn)展期肝癌，缺乏有效的治療手段。
分子生物學(xué)診斷技術(shù)已廣泛應(yīng)用于包括肝細(xì)胞癌、膽管細(xì)胞癌、混合癌在內(nèi)的原發(fā)性肝癌及膽管癌、膽囊癌等惡性腫瘤的臨床診斷、療效評(píng)估、預(yù)后判斷等各個(gè)方面。
一．臨床應(yīng)用的血清學(xué)分子標(biāo)志物
(1)甲胎蛋白、甲胎蛋白異質(zhì)體(AFP-L3)
血清甲胎蛋白及其異質(zhì)體AFP-L3是臨床上應(yīng)用最廣泛和特異性最強(qiáng)的肝細(xì)胞癌標(biāo)志物，國(guó)內(nèi)常用于肝細(xì)胞癌患者的普查、早期診斷、術(shù)后監(jiān)測(cè)和隨訪。化學(xué)發(fā)光免疫、酶聯(lián)免疫吸附和電化學(xué)發(fā)光法是其臨床常用的檢測(cè)方式。對(duì)于甲胎蛋白≥400 ng/ml超過(guò)1個(gè)月，排除妊娠、生殖腺胚胎癌和活動(dòng)性肝病的患者，應(yīng)高度考慮肝細(xì)胞癌，其診斷特異性高達(dá)99%，而敏感性僅為17%。對(duì)于甲胎蛋白陰性的患者，要定期檢測(cè)和動(dòng)態(tài)觀察，并要借助影像學(xué)檢查甚或穿刺活檢等手段來(lái)明確診斷。AFP-L3在臨床常用親和吸附離心管法檢測(cè)。
研究顯示，在甲胎蛋白不升高的情況下，有34.3%的肝細(xì)胞癌患者，在確診1年前即出現(xiàn)AFP-L3升高。當(dāng)以10%為AFP-L3的臨界值時(shí)，其對(duì)早期肝細(xì)胞癌的檢測(cè)敏感性為22%～33%，特異性為93%～94%。對(duì)于甲胎蛋白陰性(<20 ng/ml)肝細(xì)胞癌患者，AFP-L3的檢測(cè)敏感性為12%～21%,特異性為97%～98%。2005年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)將AFP-L3監(jiān)測(cè)應(yīng)用于肝細(xì)胞癌預(yù)警，并把AFP-L3≥10%作為診斷肝細(xì)胞癌的高特異性指標(biāo)。
(2)脫-γ-羧基凝血酶原(DCP)
DCP是一種不正常的凝血酶原分子。在肝細(xì)胞癌中，由于癌細(xì)胞不能正常合成凝血酶原前體，同時(shí)凝血酶原前體羧化不足，從而生成大量的DCP。目前廣泛采用ELISA試劑盒來(lái)檢測(cè)DCP，亦可采用電化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)DCP。研究發(fā)現(xiàn)，DCP≥40 mAU/ml診斷早期肝細(xì)胞癌的敏感性和特異性分別為74%和86%。日本指南建議將DCP聯(lián)合甲胎蛋白、AFP-L3作為肝細(xì)胞癌早期診斷和篩查的標(biāo)志物。
(3)糖類抗原19-9
糖類抗原19-9蛋白是一種臨床常用的腫瘤標(biāo)志物，在正常的膽管、胰腺、胃和結(jié)腸上皮細(xì)胞中均有表達(dá)。上述部位的疾病均能引起糖類抗原19-9表達(dá)升高。其常用檢測(cè)方法為微粒子酶免法(MEIA)和ELISA。糖類抗原19-9≥37 kU/L時(shí)，聯(lián)合影像學(xué)診斷CCA的敏感性為77.4%，特異性為84.7%；糖類抗原19-9≥100 kU/L提示CCA患者預(yù)后不良；出現(xiàn)梗阻性黃疸癥狀時(shí)，糖類抗原19-9診斷特異性降低。膽道引流減黃后，患者糖類抗原19-9仍維持高值，提示膽管細(xì)胞癌(cholangiocarcinoma, CCA)可能性大。糖類抗原19-9≥20
kU/L診斷膽囊癌的敏感性為50%，特異性為92.7%。
(4)癌胚抗原
癌胚抗原是一種參與細(xì)胞黏附的細(xì)胞表面糖蛋白，是結(jié)直腸癌的診斷標(biāo)志，也是肺癌患者的預(yù)后標(biāo)志物，在健康成人血液中難以檢測(cè)到。因其易受吸煙等因素影響，故無(wú)法作為CCA的獨(dú)立診斷或預(yù)后標(biāo)志物。臨床常用放射免疫檢測(cè)或ELISA方法對(duì)血清癌胚抗原進(jìn)行定量。癌胚抗原≥5 ng/ml時(shí)，診斷CCA的敏感性為33%，特異性為85%；癌胚抗原≥4 ng/ml時(shí)，診斷膽囊癌的敏感性為79.4%，特異性為79.2%。目前傾向推薦腫瘤標(biāo)志物糖類抗原19-9聯(lián)合癌胚抗原和糖類抗原125，以提高CCA鑒別診斷率(其中糖類抗原125≥35
kU/L)。
二．臨床應(yīng)用的病理組織學(xué)分子標(biāo)志物
肝細(xì)胞癌的組織學(xué)分子標(biāo)志物主要包括：肝細(xì)胞抗原(HepPar)-1、磷脂酰肌醇聚糖(GPC-3)、精氨酸酶-1、甲胎蛋白、低分子角蛋白(CK)8和CK18，其中HepPar-1、精氨酸酶-1、GPC-3和甲胎蛋白特異性較好，而CK7、CK19是正常小葉間膽管的標(biāo)記物，因此可作為CCA的標(biāo)記物。
在少數(shù)肝細(xì)胞癌中，CK19和CK7也可表達(dá)，而表達(dá)時(shí)則提示患者預(yù)后不良。在肝細(xì)胞癌的早期診斷方面，聯(lián)合應(yīng)用GPC-3、熱休克蛋白-70和谷氨酰胺合成酶具有重要診斷價(jià)值。
這3個(gè)免疫標(biāo)志物中2項(xiàng)陽(yáng)性則考慮為肝細(xì)胞癌。CCA的主要組織學(xué)診斷標(biāo)志物包括CK7、CK19、熱休克蛋白70、黏蛋白-1。基于抗原-抗體免疫反應(yīng)的免疫病理檢測(cè)，并密切結(jié)合形態(tài)學(xué)，已成為PLC病理診斷與鑒別診斷的常規(guī)手段。
三．處于探索階段的血清學(xué)分子標(biāo)志物
(1)高爾基蛋白(GP)73
GP73是上皮細(xì)胞特異性的跨膜蛋白，在正常肝臟匯管區(qū)周?chē)哪懝苌掀ぜ?xì)胞低表達(dá)，在大部分的正常肝細(xì)胞中不表達(dá)，在肝組織病變時(shí)表達(dá)上調(diào)。肝細(xì)胞癌患者外周血GP73水平更是明顯升高。臨床上常用ELISA方法檢測(cè)GP73。當(dāng)血清GP73≥10 U/ml(相對(duì)值)時(shí)，診斷肝細(xì)胞癌的敏感性為69%，特異性為75%。需要注意的是，GP73并不是一個(gè)肝細(xì)胞癌特異性標(biāo)志物，它在腎細(xì)胞癌、前列腺癌中都有表達(dá)。同時(shí)，血清GP73升高不顯著時(shí)，需與肝硬化相鑒別。
(2)磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC)-3
GPC-3是一種細(xì)胞膜表面蛋白聚糖，參與多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程，可用ELISA或放射免疫法檢測(cè)。在乙型肝炎和丙型肝炎患者血清中，GPC-3≥300
ng/ml診斷肝細(xì)胞癌的敏感性為53%，特異性為77%。在患者肝細(xì)胞癌組織中，免疫組化檢測(cè)GPC-3陽(yáng)性時(shí)，診斷肝細(xì)胞癌的敏感性為97.7%，特異性為91.3%。
(3)循環(huán)腫瘤細(xì)胞DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)突變
ctDNA是腫瘤細(xì)胞釋放到外周血中的游離DNA。應(yīng)用ctDNA的特征性突變結(jié)合血清蛋白標(biāo)志物檢查，可以診斷出卵巢、肝臟、胃、胰腺、食道、結(jié)腸、肺或乳腺等8種常見(jiàn)腫瘤，檢出陽(yáng)性率的中位值為70%，其中肝細(xì)胞癌的陽(yáng)性檢出率達(dá)到96.1%。在不依賴臨床信息的情況下，上述方法可以鑒定出44%肝細(xì)胞癌患者，聯(lián)合臨床信息檢出率可達(dá)到63%。
另一項(xiàng)聯(lián)合了ctDNA檢查的肝細(xì)胞癌高頻突變與血清中甲胎蛋白、DCP水平檢測(cè)開(kāi)發(fā)的"肝細(xì)胞癌篩查系統(tǒng)"，可以從乙肝表面抗原陽(yáng)性的無(wú)癥狀慢性乙肝人群中篩查出肝細(xì)胞癌患者，其診斷敏感性85%，特異性93%，并有助于提前發(fā)現(xiàn)潛在的肝細(xì)胞癌患者，其診斷敏感性100%，特異性94%。
(4)ctDNA甲基化
DNA甲基化的改變與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，且這種改變被認(rèn)為發(fā)生在遺傳學(xué)改變之前。外周血ctDNA的甲基化檢測(cè)，是近年腫瘤另一種無(wú)創(chuàng)早期診斷方法。研究顯示，對(duì)組織和外周血樣本差異性甲基化位點(diǎn)結(jié)合臨床特征所構(gòu)建的診斷模型，對(duì)于鑒別肝細(xì)胞癌的敏感性達(dá)84.8%，特異性為93.1%，同時(shí)有助于預(yù)測(cè)腫瘤的分期、療效和復(fù)發(fā)。在2019年歐洲腫瘤內(nèi)科學(xué)年會(huì)上公布的一項(xiàng)大樣本多中心臨床試驗(yàn)顯示，用肝細(xì)胞癌等20余種腫瘤及健康志愿者外周血甲基化測(cè)序后構(gòu)建的腫瘤早篩預(yù)測(cè)模型，診斷腫瘤的總體特異性為99.4%，敏感性為54.7%。
(5)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)
TERT基因啟動(dòng)子區(qū)突變?cè)诖蠖鄶?shù)腫瘤中都存在。在膽囊癌中TERT啟動(dòng)子突變頻率為9.1%；在肝外膽管癌(extrahepatic cholangiocarcinoma, ECC)中出現(xiàn)的頻率約為6.7%；在肝細(xì)胞癌中出現(xiàn)的頻率約為0.5%～57.2%。TERT啟動(dòng)子區(qū)變異在低級(jí)別和高級(jí)別肝臟增生性結(jié)節(jié)中經(jīng)常出現(xiàn)，被認(rèn)為是肝細(xì)胞癌發(fā)生的早期分子事件，可作為潛在的輔助臨床診斷標(biāo)志物。
(6)微小RNA
微小RNA是由21－25個(gè)核苷酸構(gòu)成的非編碼小分子RNA，具有組織特異性、腫瘤特異性、可由外泌體途徑分泌入血及穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)，已被發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌診斷和協(xié)同診斷中具有重要作用。血漿中檢測(cè)到的微小RNA，包括微小RNA-122、192、21、223、26a、27a、801等，可鑒別診斷肝細(xì)胞癌，其曲線下面積為0.84～0.94。同時(shí)，微小RNA-26a在肝細(xì)胞癌組織中低表達(dá)的患者，可以在肝癌切除術(shù)后的干擾素輔助治療中顯著獲益。
四、專家推薦意見(jiàn)
(1)建議使用血清學(xué)甲胎蛋白、AFP-L3以及DCP聯(lián)合檢測(cè)，結(jié)合患者影像學(xué)表現(xiàn)，作為臨床肝細(xì)胞癌篩查、診斷的標(biāo)志物。
(2)建議結(jié)合組織形態(tài)學(xué)，病理組織檢測(cè)HepPar-1、精氨酸酶-1、GPC-3和甲胎蛋白，作為肝細(xì)胞癌病理診斷的免疫標(biāo)志物；聯(lián)合應(yīng)用GPC-3、熱休克蛋白-70和谷氨酰胺合成酶作為早期肝細(xì)胞癌臨床病理診斷(3項(xiàng)免疫標(biāo)志物中2項(xiàng)陽(yáng)性)的免疫標(biāo)志物；CK7、CK19和黏蛋白-1作為CCA臨床病理診斷的免疫標(biāo)志物。
(3)建議使用血清學(xué)糖類抗原19-9、125及癌胚抗原聯(lián)合檢測(cè)，結(jié)合影像學(xué)特點(diǎn)作為CCA臨床診斷的標(biāo)志物。
(4)建議使用血清學(xué)糖類抗原19-9檢測(cè)，結(jié)合影像學(xué)特點(diǎn)作為膽囊癌臨床診斷的標(biāo)志物。
(5)ctDNA、微小RNA等血清學(xué)標(biāo)志物，由于檢測(cè)成本較高，且缺乏大規(guī)模臨床試驗(yàn)結(jié)果論證，缺乏組織和腫瘤特異性特征，建議可作為肝膽腫瘤患者診斷及篩查的參考指標(biāo)。
(6)建議肝膽腫瘤根治性治療術(shù)后，參考使用上述血清學(xué)標(biāo)志物結(jié)合影像學(xué)檢查進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。
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