論文匯編新型冠狀病毒核酸臨床檢測要點及經驗
2019新型冠狀病毒(以下簡稱新冠病毒)是一種新型β屬冠狀病毒,屬于單鏈RNA病毒,可引起人類呼吸道感染,其基因特征與嚴重急性呼吸綜合征(SARS)相關冠狀病毒和中東呼吸綜合征(MERS)相關冠狀病毒有明顯區別,基因組序列約由29kb構成,擁有10個基因,可有效編碼10個蛋白。該病毒感染人類引起的肺炎自2019年12月在湖北省武漢市發現以來,截至2月22日24時,據31個省(自治區、直轄市)及新疆生產建設兵團報告,現有確診病例51606例(其中重癥病例10968例)。國際病毒分類委員會于2020年2月12日正式將其命名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)。由于疫情發展迅速,對不同程度臨床癥狀患者及疑似患者進行診斷需要快速有效的方法,而新冠病毒核酸檢測可為診斷提供直接證據,在目前最新版本診療方案中,新冠病毒核酸的檢出仍是唯一確診依據。由于是新發疾病,從新冠病毒所致感染病程到新冠病毒核酸檢測技術等各個方面均缺乏大量科學數據支撐,在開展核酸檢測過程中的各個環節中存在較多問題。本文將圍繞目前新冠病毒核酸檢測中的關鍵環節及其中可能影響核酸檢測結果及時性、準確性的因素進行評述。
1、新冠病毒核酸檢測方法
在疫情初期,最先檢出新的病原體的方法是下一代測序技術/高通量測序(NGS)技術,并很快確定了新冠病毒的核酸序列。隨著疫情發展,國內迅速研發出多種應用于新冠病毒核酸檢測的試劑盒,絕大多數都基于實時熒光定量PCR(qPCR)技術。此外也有非常多的快速基因檢測技術推出,如現場快速檢驗(POCT)技術、卡式熒光PCR 技術等,整個檢測流程時間較短,最多可以節約3~4 h。和傳統的qPCR技術相比,一體化POCT確實便攜、操作簡單,但是如果過于強調其"快速"的特性,其靈敏度可能受到影響,而現實的問題是傳統PCR 技術都受到“假陰性”結果的挑戰,在現有條件下,時間的縮短可能會進一步帶來一定程度的靈敏度降低。從技術角度看,在靈敏度和特異性的平衡上,相較一些快速檢測方法,目前平衡性最好的是qPCR檢測技術。從過往的重大疫情來看,無論是西非埃博拉病毒、甲型流感還是MERS,qPCR仍是各個部門主推的檢測手段,目前我國已批準上市的試劑盒也均以qPCR技術為主。目前新冠病毒核酸檢測針對的位點主要包含病毒基因組中3段保守基因序列,即以開放讀碼框1ab(ORF1ab)、核殼蛋白(N)基因以及包膜蛋白(E)基因作為檢測靶標,也有少數商品試劑盒同時檢測刺突糖蛋白(S)基因。根據國家衛生健康委員會發布的《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南(第五版)》(以下簡稱“實驗室檢測技術指南”),在實驗室要確認一個病例為陽性,需滿足同一份標本中新冠病毒的ORF1ab及N 基因2個靶標特異性qPCR 檢測結果均為陽性,或單靶標陽性患者重新采樣/另一類型標本檢測仍為單靶標陽性,故實驗室針對新冠病毒的核酸檢測應至少包含最為保守及特異的ORF1ab區域以及N 基因。
2、新冠病毒核酸檢測標本類型及病毒核酸檢出情況
2.1 不同標本類型中新冠病毒的核酸檢測
在最新版診療方案中,其確診所提到的核酸檢測標本類型不僅包含呼吸道標本及血液標本,同時在實驗室檢查中增加“糞便標本中可檢測新型冠狀病毒核酸”。實驗室檢測技術指南中,又將標本類型細分,呼吸道標本包含鼻咽拭子、咽拭子、鼻咽抽取物或呼吸道抽取物、深咳痰液、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液;消化道標本包含糞便及肛拭子;血液標本包含全血及血清標本,并分別有相應的采集及保存要求。由于新冠病毒造成的肺炎為下呼吸道感染,對于已有癥狀及肺部CT改變的患者來說,下呼吸道標本(如深咳痰液、灌洗液等)為核酸檢測首選,而在新冠肺炎不同病程中取上呼吸道標本(如鼻咽拭子)也能檢出病毒核酸。臨床上由于多數患者咳痰困難,取下呼吸道灌洗液標本操作的生物安全風險極大,故呼吸道標本以鼻咽拭子及咽拭子為主,而拭子標本采用目前的qPCR試劑盒進行檢測,只有30%~50%的陽性檢出率,大量的假陰性結果無法避免,必須進行多次取樣檢測或結合其他類型標本檢查結果進行確診。筆者所在研究團隊對臨床上的新冠病毒疑似病例分別采集不同類型呼吸道標本進行核酸檢測,結果初步提示在新冠病毒感染者中,取咽拭子標本及深咳痰液標本的病毒核酸檢出率之間有明顯差異,咽拭子標本中新冠病毒陽性檢出率低于深咳痰液標本。隨著對新冠病毒核酸檢測的科技攻關,目前已有較多報道提出在患者的糞便標本中可檢出病毒核酸,糞便標本將成為臨床患者篩查的重要標本類型。目前筆者所在研究團隊對呼吸道標本核酸檢測確診的患者進行治療過程中及出院前的糞便標本進行核酸檢測,結果顯示糞便標本是患者診療過程中一種非常好的標本類型,其核酸檢出的持續時間普遍較呼吸道標本更長,同時糞便中新冠病毒核酸陽性與患者的疾病發展進程具有重要的相關性,可能作為一種療效評估和出院標準的重要檢測指標。
2.2 不同呼吸道標本取樣材料對新冠病毒核酸檢測結果的影響
目前相關的診療方案及實驗室檢測技術指南并未提及用于采集鼻咽拭子及咽拭子的拭子種類,但對于呼吸道標本的病毒核酸檢測來說,不同的拭子及保存管很大可能將影響核酸檢測結果,但相關影響因素尚未見報道。筆者所在研究團隊初步在確診患者中對比了帶病毒保存液的植絨拭子標本及無病毒保存液的普通棉簽拭子標本的新冠病毒核酸檢測結果,發現普通棉簽拭子的核酸檢出率明顯低于帶病毒保存液的植絨拭子(P <0.05),普通棉簽拭子即便檢出,其陽性CT值也明顯大于植絨拭子。
3、新冠病毒核酸檢測標本核酸提取方法及病毒核酸檢出情況
實驗室檢測技術指南等文件中,并未明確提及或推薦新冠病毒標本的核酸提取方法,但由于目前臨床常見鼻咽拭子標本存在核酸檢出率較低的問題,對提取方法及提取流程進行有實驗數據依據的選擇及優化是有必要的,提取流程的優化可由各實驗室根據自身情況及比對實驗結果來進行。新冠病毒核酸檢測所采用的qPCR
是臨床分子檢測中常用的檢測方法,在以往采用qPCR對病毒核酸進行的檢測中,磁珠法是較為常用的核酸提取方法,普遍認為其提取病原體的核酸時具有簡便、高效、提取濃度及純度較高等優勢。此外因各實驗室條件不同及各檢測試劑盒要求,離心柱法、煮沸裂解法、一步裂解釋放法等也在臨床大量應用。不同的病毒核酸提取方法因其提取產物濃度、純度的差別及對RNA 的保護程度不同,將在一定程度上影響病毒核酸尤其是臨界陽性標本的核酸檢出。筆者所在研究團隊初步對58例已確診患者原始標本(均為帶病毒保存液的咽拭子標本)同時采用不同提取方法后的核酸檢測結果顯示,分別采用離心柱法及磁珠法提取后,PCR 檢測的CT 值差異無統計學意義(P
>0.05)。
4、新冠病毒核酸檢測實驗室生物安全要求
4.1 實驗室及檢驗人員生物安全
自新冠肺炎疫情暴發以來,各醫院檢驗科在面對新冠病毒標本檢測量增加、確診/疑似病例和普通患者的標本不易區分、實驗室空間限制、生物安全防護物資不足等各類問題時,臨床實驗室特別是進行新冠病毒核酸檢驗科室的生物安全防護措施尤為關鍵。目前國家衛生健康委員會對新冠病毒暫按照病原微生物危害程度分類中第二類病原微生物進行管理,根據實驗室檢測技術指南及實驗室生物安全指南,如無法對原始標本進行可靠的滅活,則對其進行的核酸檢測應當在生物安全二級實驗室進行,同時采用生物安全三級實驗室的個人防護(建議至少穿戴工作服、一次性工作帽、雙層手套、醫用一次性防護服、醫用防護口罩或動力送風過濾式呼吸器、防護面屏或護目鏡、工作鞋或膠靴、防水靴套),各實驗室還可根據自身情況增加進一步的防護;同時標準預防、不定期通風和手衛生等重要的防護措施必不可少。
在物資匱乏及實驗室條件不足等限制下,實驗室可根據物資短缺的情況,對檢驗標本及檢驗崗位等啟動分級、分層的生物安全防護預案,根據擬定的不同防護級別,最大限度滿足生物安全防護要求。如針對
不同的檢驗崗位,建議至少應保證對確診患者、疑似患者標本進行呼吸道標本病毒核酸提取和抗原檢測的相關人員的核心防護,即三級生物安全防護、二級生物安全柜,有條件時應佩戴正壓防護頭套及在負壓實驗室中操作,其他實驗室檢測人員酌情采取重點防護或標準防護。同時應加強所有實驗室人員的安全意識,在日常進行新冠病毒核酸檢測的實驗室內,所有實驗人員均應嚴格遵循新冠病毒實驗室生物安全指南中的相應要求,結束核酸檢測工作后,對進行新冠病毒核酸檢測操作的安全柜、臺面及實驗室環境及時進行有效的消毒;同時應嚴格按照相關文件要求進行防護裝備的脫卸,注意盡量少地觸碰到污染面,且脫卸的每一步后均應有手消毒,防護服、醫用帽及醫用口罩等一次性物品盡量不重復使用,在全部脫卸完成后,再進行相應的手衛生及消毒。對于嚴格分區的實驗室,在相應區域完成防護裝備脫卸及手衛生即可進入清潔區,未嚴格分區的實驗室中檢驗人員在完成防護裝備脫卸及手衛生后,還可增加其他有效的消毒措施。
4.2 原始標本的滅活及對核酸檢測的影響
新冠病毒實驗室檢測指南中未對原始標本的有效滅活條件進行規定或建議,在目前最新的新冠病毒核酸檢測專家共識中,建議采用56 ℃水浴45 min,并可根據提取試劑在標本裂解時所采用的溫度調整滅活溫度,但不低于56 ℃,此條件是依據以往對MERS等病毒滅活條件的研究。同時專家共識也建議各實驗室對原始標本的滅活條件有預實驗結果的支持。由于目前常見標本類型的新冠病毒核酸陽性檢出率仍不高,故任何可能降低病毒核酸提取效果及檢出率的因素,如標本滅活條件及滅活時間等均應引起重視。此前,華中科技大學附屬同濟醫院檢驗科的專家學者對PCR檢測病毒核酸(以乙型流感病毒為例)進行了相應的小標本量比對,結果發現未滅活處理、56 ℃ 水浴30
min及50 ℃干浴1 h的同一標本其PCR 檢測陽性結果的擴增曲線CT 值無明顯變化,可作為新冠病毒標本滅活的參考。根據筆者所在研究團隊對20例新冠病毒感染者的同一陽性標本分別進行56 ℃干浴30 min及65 ℃干浴30 min后,其PCR 檢測的陽性CT值差異無統計學意義(P >0.05),該研究結果尚未發表。
5、新冠病毒核酸檢測結果判讀
根據目前最新版新冠病毒診療指南、防控方案及實驗室檢測專家共識,對新冠病毒的核酸檢測均應至少檢測ORF1ab及N 基因(或E 基因),檢測的通道同時陽性時可判定為陽性,并均提到陰性結果不能排
除新冠病毒感染,應考慮各環節中導致假陰性的原因。同時在實驗室檢測技術指南中,對于單通道陽性結果,不僅要求重新采樣及檢測,對結果判定也增加了新的要求,即重新檢測結果仍為單通道陽性時,判
定核酸檢測結果為陽性;同時增加了2種類型標本均檢測得到單靶標陽性結果時,應判定核酸檢測結果為陽性。對于臨床新冠病毒核酸檢測中經常出現的單靶標陽性結果,可有如下幾點考慮。(1)不同廠家雙位點qPCR試劑盒對于新冠病毒N 蛋白基因的擴增靈敏度可能高于ORF1ab檢測,將可能導致部分病毒含量較低的標本檢測結果為單通道陽性。(2)專研SARS病毒的專家學者認為,理論上講新冠病毒的mRNA 轉錄模式與SARS類似,在細胞中新冠病毒的mRNA 數倍于病毒的基因組RNA,且將轉錄出不同長度的mRNA,這些mRNA 都帶有N 基因,而只有少數帶有ORF1ab;目前的試劑盒實際檢測多為細胞內的病毒mRNA,因患者標本中N 基因mRNA 的拷貝數遠高于ORF1ab基因,故在新冠病毒拷貝數較低的情況下,N 基因檢測單通道陽性的比例較高。(3)N 基因在新冠病毒的核酸序列中保守程度不及ORF1ab,故還可能存在少數標本由于其他冠狀病毒等的核酸序列與其有交叉,導致N 基因擴增陽性而ORF1ab陰性。
6、結 論
綜上所述,目前新冠病毒所致疾病其病理過程及臨床病程還未完全闡明,實驗室檢測路徑未標準化,加上其核酸檢測試劑盒研發時間緊迫,沒有足夠的評估及大樣本量的臨床驗證,檢測效果良莠不齊,故對于臨床上新冠病毒核酸檢測結果為陰性或單通道陽性的標本均需要謹慎對待,考慮到各環節中可能造成結果不準確的影響因素。各臨床實驗室應在現有研究報道及文件和指南的基礎上,根據自身條件對新冠病毒核酸檢測全過程進行嚴格的質量控制及合理的優化。同時,目前實驗室已開始檢測新冠病毒IgM 及IgG抗體,更靈敏的核酸檢測方法如數字PCR也開始應用于新冠病毒的核酸檢測,部分研究團隊著力于探索更加高效的新冠病毒實驗室診斷模型,有望在新冠病毒的實驗室檢測方面大大降低假陰性率,并為更好更快地確診新冠病毒感染者提供事實依據。
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