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PCR實驗室防污染措施及應急處理方法

文章來源:發布時間:2021年12月23日瀏覽量: 字體:

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PCR實驗室防污染措施及應急處理方法



PCR實驗室的污染來源



1、樣本間交叉污染:



收集樣本的容器被污染或樣本密封不嚴外溢;不同樣本移液時忘記更換槍尖或未使用帶濾芯槍尖;移液器等實驗器具及耗材未及時消毒滅菌;不同樣本同時開蓋或樣本劇烈震蕩、反復吹吸導致氣溶膠形成擴散,相互交叉污染。



2、實驗試劑污染:



主要是在
PCR 組分試劑加樣過程中,由于移液器、容器、陰性對照及其它試劑被核酸模板或陽性對照污染。
 加樣過程中,因為 PCR 試劑對溫度十分敏感,需要通過冰浴使得 PCR 試劑和 PCR 板/管處于 0℃,但這個過程也是充滿了污染的風險的。



3、擴增產物污染:



大量拷貝的產物泄漏或擴增后的PCR反應管意外開蓋,這是 PCR 反應中最主要最常見的污染問題。因為 PCR 產物拷貝量大,遠遠高于 PCR 檢測數個拷貝的極限,所以極微量的 PCR 產物污染,就可形成假陽性。



4、克隆質粒污染:



作為陽性質控品的克隆質粒外溢。



PCR實驗室的防污染方法



按照實驗室的安全工作制度或安全標準操作程序,所有操作符合《實驗室生物安全通用要求》(GB19489-2008)。



1、嚴格執行各區功能劃分:



試劑儲存和準備區:貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴增反應混合液的準備,以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準備。



標本制備區:核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管。對于涉及臨床樣本的操作,應符合生物安全二級實驗室防護設備、個人防護和操作規范的要求。



擴增區:cDNA合成、DNA擴增及檢測。



擴增產物分析區:擴增片段的進一步分析測定,如雜交、酶切電泳、變性高效液相分析、測序等。



試劑準備區、樣本制備區和擴增區內的實驗用品,包括移液器等器具應專用,空氣、物品流向依次為:試劑準備區、樣本制備區、擴增區、產物分析區,不可逆行。



2、清潔的實驗用品:



實驗室自配試劑(去離子水、緩沖液等)和所有使用器具在使用之前均應高壓滅菌或紫外殺菌。槍尖、反應管等實驗耗材應一次性使用。



3、正確的實驗操作:



實驗應在超凈工作臺內進行,工作臺內應放置PCR專用的微量離心機、各量程的移液器和其他必須物品。



實驗的過程中選擇最合適尺寸的手套并能及時更換,在進出不同實驗區域或進行模板操作后都應更換實驗服、口罩、帽子及手套,以避免不同實驗區交叉污染。



裝有PCR試劑的反應管在打開之前應先瞬時離心,將管壁及管蓋上的液體離至管底,降低污染手套或加樣器的風險;謹慎開啟反應管,防止管內液體濺出或形成氣溶膠導致污染。



吸加試劑和模板的操作應嚴格按照規范要求進行,遵守“慢吸快打”原則,盡量一次性完成,忌多次抽吸,以避免氣溶膠產生的交叉污染。



PCR試劑建議小量分裝,以減少反復凍融、重復取樣次數;多樣本PCR反應時,先配制反應混合液分裝至反應管中,最后加入樣本核酸,請勿同時開蓋,盡量保證單人單管,實現完全閉管操作。



實驗試劑應與樣品和PCR產物分開保存,不應放于同處。



PCR擴增實驗完成后及時將反應管取出,用一次性手套將產物反應管包裹丟棄,保證管蓋緊閉。



4、規范的實驗設計:



應遵循實驗室內部質量控制的相關規定,實驗中設立陽性對照、陰性對照和空白對照,全程質控實驗過程,驗證PCR反應的可靠性,并協助判斷擴增系統的可信性。



PCR實驗室的污染應急處理方法



1、若核酸樣本溢出:



立即用布或紙巾覆蓋,由外圍向中心傾倒10%的次氯酸消毒劑,約30分鐘后,清除污染物品,再用次氯酸消毒劑擦拭,并用75%酒精噴灑,移動紫外車定點照射1小時。



2、其他不明情況污染:



1、暫停所有實驗操作;



2、清理實驗室內所有物品,尋找污染來源;



3、加大實驗室的通風;



4、對實驗室內所有表面(臺面、地面及墻面) 進行消毒;



5、75%酒精空中噴霧;



6、開啟紫外消毒裝置,延長紫外照射時間(4小時以上);



7、以上措施每日進行,直至污染消除;用新試劑及確認無污染的器材進行原污染項目的試劑空白檢測,連續3次均陰性后方可進行常規檢測。


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