PCR過(guò)程的內(nèi)源性與外源性?xún)?nèi)標(biāo)

文章來(lái)源：發(fā)布時(shí)間：2022年06月14日瀏覽量：次 字體： 大 中 小

常規(guī)熒光定量PCR的流程是：樣品采集-運(yùn)輸-樣品處理-核酸提取-反轉(zhuǎn)錄（RNA病毒）-擴(kuò)增-結(jié)果讀取。但是因?yàn)闃?biāo)本采集、核酸提取和PCR反應(yīng)過(guò)程等多個(gè)過(guò)程都有存在假陰性的可能，所以為了更好的避免這種情況，核酸檢測(cè)試劑往往會(huì)設(shè)計(jì)內(nèi)對(duì)照，也就是我們常說(shuō)的—內(nèi)標(biāo)。

內(nèi)標(biāo)是指在同一反應(yīng)管中與靶序列共同擴(kuò)增的一段非靶序列分子。內(nèi)標(biāo)有兩種形式，一種是使用天然樣品中含有的內(nèi)參基因作為內(nèi)標(biāo)，另一種是人工添加的內(nèi)標(biāo)。內(nèi)標(biāo)的最大特點(diǎn)是與靶序列共同擴(kuò)增，如果內(nèi)對(duì)照無(wú)擴(kuò)增曲線，則提示實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)存在問(wèn)題，該標(biāo)本實(shí)驗(yàn)無(wú)效。

內(nèi)對(duì)照分為兩類(lèi)：內(nèi)源性?xún)?nèi)標(biāo)和外源性?xún)?nèi)標(biāo)

一、內(nèi)源性?xún)?nèi)標(biāo)

內(nèi)源性?xún)?nèi)標(biāo)，通常它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，在檢測(cè)基因的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來(lái)做參照物。內(nèi)參基因通常是持家基因（house-keeping gene）因?yàn)槠浔磉_(dá)水平受環(huán)境因素影響較小，而且在個(gè)體各個(gè)生長(zhǎng)階段的幾乎全部組織中持續(xù)表達(dá)變化很小。常用的內(nèi)參基因包括GAPDH、β-actin(BETA-actin)、18sRNA、B2M、HPRT和TBP等。

這些基因在人體各器官組織細(xì)胞中普遍存在，存在于采集的咽拭子等標(biāo)本中，因此可以檢測(cè)是否采集到了上皮細(xì)胞及整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程的準(zhǔn)確性，由于人基因組和病毒提取效率存在一定差別，內(nèi)源性?xún)?nèi)標(biāo)無(wú)法完全監(jiān)測(cè)提取過(guò)程中存在的問(wèn)題。

優(yōu)勢(shì)：

與樣品中的靶基因經(jīng)歷完全相同的處理程序，可以監(jiān)控采樣，運(yùn)輸，核酸提取和擴(kuò)增的全部過(guò)程，既可以監(jiān)測(cè)是否采集到的足夠量的樣本細(xì)胞，又可以監(jiān)測(cè)提取和擴(kuò)增檢測(cè)過(guò)程。

劣勢(shì)：

不同物種，不同生理狀態(tài)下，不同組織中的內(nèi)參基因存在一定的差異，同時(shí)人基因組和病毒提取效率存在一定差別，如果樣品類(lèi)型是口腔液，咽拭子等樣品，內(nèi)參基因的量很低可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)不成立。如果檢測(cè)的是環(huán)境樣品則內(nèi)參基因可能完全失效。

二、外源性?xún)?nèi)標(biāo)

外源性?xún)?nèi)標(biāo)又可以分為兩種，一種是國(guó)外常用的添加一種不會(huì)干擾靶序列擴(kuò)增的人工合成的內(nèi)標(biāo)，直接添加在反應(yīng)液中與模板一起擴(kuò)增，能監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過(guò)程。另一種是使用人工合成的假病毒，在核酸提取前在每一份樣品中加入等量的內(nèi)標(biāo)，這樣就可以監(jiān)控樣品的提取到擴(kuò)增的過(guò)程。

常用的是MS2噬菌體等假病毒，在臨床標(biāo)本制備前加入，然后與標(biāo)本中的靶核酸一起經(jīng)歷核酸提取過(guò)程，可以較全面地監(jiān)測(cè)從核酸提取到產(chǎn)物分析全過(guò)程的有效性。外源性?xún)?nèi)標(biāo)不但可以監(jiān)測(cè)標(biāo)本中PCR抑制物及核酸提取中試劑的混入所致的假陰性外，而且還可以監(jiān)測(cè)因?yàn)镻CR擴(kuò)增儀孔位間溫度的不準(zhǔn)確及核酸的提取效率太低所致的假陰性。

優(yōu)勢(shì)：

能更好的反映核酸提取及擴(kuò)增檢測(cè)過(guò)程（外源性?xún)?nèi)標(biāo)的假病毒與真實(shí)病毒模板在基因序列上相近，因此擴(kuò)增效率相近）。是對(duì)臨床樣本中可能存在的抑制/干擾物的質(zhì)控措施。

劣勢(shì)：

不能監(jiān)測(cè)是否采集到足量的細(xì)胞樣本，存在競(jìng)爭(zhēng)抑制的可能。但是這樣的內(nèi)標(biāo)不能監(jiān)控采樣，運(yùn)輸和核酸提取的過(guò)程，不能監(jiān)控胞內(nèi)細(xì)菌病毒的釋放情況。

從上文可知沒(méi)有一種對(duì)照是完美的，在檢測(cè)中我們要根據(jù)自己的需求來(lái)進(jìn)行靈活選擇和搭配。建議每一次檢測(cè)時(shí)添加一個(gè)能對(duì)從提取到擴(kuò)增環(huán)節(jié)進(jìn)行監(jiān)控的質(zhì)控品或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；每份檢測(cè)樣品中添加內(nèi)標(biāo)（如果樣品種類(lèi)比較多樣建議使用人工內(nèi)標(biāo)，如果樣品類(lèi)型為相對(duì)固定的動(dòng)物組織建議使用內(nèi)參基因）

內(nèi)標(biāo)設(shè)置是為了避免“假陰性”的出現(xiàn)，監(jiān)控整個(gè)反應(yīng)過(guò)程是否順利進(jìn)行，無(wú)論內(nèi)源性?xún)?nèi)標(biāo)還是外源性?xún)?nèi)標(biāo)都可以滿足。

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