檢驗質控羅氏HbA1c是怎樣實現患者新鮮全血樣品HbA1c
檢測結果的溯源性的
在2000年前后，IFCC公布了檢測新鮮全血HbA1c的一級參考方法和一級參考物質。
IFCC定義的HbA1c，是血紅蛋白A上β鏈的N-端纈氨酸被糖化的血紅蛋白！ 而且，在IFCC的HbA1C參考方法中，明確從β鏈的N-端的第一個氨基酸纈氨酸起，共六個氨基酸的位置都算在里面！即：只有在這個六肽的序列上都完全與它一致的，才可被認可為真正的HbA1C！ 只說明在血紅蛋白β鏈上N-端的纈氨酸被糖化的血紅蛋白為HbA1C是錯誤的。為了確保IFCC定義在IFCC參考方法中的真正實施，IFCC參考方法以酶切六肽為基礎。因此，衡量是否為IFCC定義的HbA1C，必須是HbA上β鏈N-端纈氨酸糖基化后的、加上余下五肽血紅蛋白。 這有羅氏資料為憑。為什么非要說清楚這六個氨基酸的肽鏈？
為什么IFCC專家對HbA的β鏈N-端，無論是否被糖化的絕對[HbA1C]和定義未被糖化的絕對[HbA0]，是被酶切下的六肽？由于IFCC工作組充分考慮到，Hb變異體在蛋白結構上的突變多發生于HbA的β鏈N-端起，計算的第六個氨基酸位置：
該圖說明，HbA的N-端第六個氨基酸為谷氨酸（Glu）；但是HbS變異體N-端第六個氨基酸是纈氨酸（Val）；HbC變異體N-端的第六個氨基酸是賴氨酸（Lys）。因此，IFCC參考方法使用的酶切方法，以切到六肽為好。因為形成的六肽最后若不是谷氨酸，說明該糖化血紅蛋白不是HbA1c。
什么是HbA0？在HbA0制備的整個過程中，IFCC專家確實是做到了：不僅在β鏈的N-端纈氨酸沒有被糖化，連任何β鏈上具有賴氨酸上的ε的-NH2被糖化的，均被清除干凈，真正成為非糖化的HbA的β鏈。
IFCC對HbA1c的檢測，使用的參考物質就是上述符合IFCC定義的HbA1c和HbA0。IFCC參考方法以這樣的參考物質校準后，使患者新鮮全血檢測的HbA1c，完全符合IFCC的嚴格定義。問題是，按照IFCC的參考方法檢測原理和操作程序，根本無法在常規中實現。
常規HbA1C的檢測方法
以羅氏為代表的免疫方法為例。第一個遭遇的問題是：計算HbA1C需要總的血紅蛋白量。在IFCC中，它只使用了未被糖化的HbA的β鏈，加上被糖化的HbA1C（即被糖化的HbA的β鏈N-端纈氨酸糖基化產物）。其他的均不計在內。這樣的做法，無法在常規使用！因此，在常規檢測方法中，還是采用了被IFCC參考方法定義否認的總血紅蛋白，即以三價鐵的血紅蛋白紅色，進行比色檢測。
這樣，常規檢測HbA1C的分母，不是IFCC確定的Hb的β鏈的，糖化和非糖化的總量；而是樣品中所有各類血紅蛋白的總和。帶來的問題是，計算的HbA1C的分母部分被放大，如果分子部分檢測的HbA1C完全符合IFCC定義的話，勢必造成最后檢測結果偏低。這也正是形成免疫檢測方法早期遭遇的問題。被解釋為免疫方法有干擾了。
在最早形成免疫方法時，是設計制備了抗8~10肽的抗體。由于上述的原因，免疫方法發現，如果將檢測糖基化的血紅蛋白抗體縮短為檢測N-端纈氨酸起的4肽，檢測結果與三價鐵離子的比色總血紅蛋白配合，可以對患者樣品檢測結果，與IFCC參考方法的結果具有強烈的可比性。使用IFCC提供的具有IFCC HbA1C參考值的新鮮全血，羅氏為它的HbA1C免疫系統，建立的公司一級校準品；并由此逐級傳遞，最后形成了羅氏公司的HbA1C校準品。
羅氏的HbA1C免疫方法系統，與IFCC參考系統，一起對新鮮患者樣品的比對，證實了在檢測量值上的一致。說明常規羅氏系統對全血內HbA1C的檢測結果量值，可以溯源至IFCC參考系統。而且在常規使用中，特別是美國NGSP網頁上，公布的資料說明，羅氏產品基本不受變異體的影響。應該說十分完美。
但是，深入思考后，你會發現：溯源性的比較數據的完美，并不說明常規檢測方法的完美。 由于檢測總血紅蛋白的局限性，迫使免疫方法檢測抗體縮短了抗N-端多肽的真實檢測的氨基酸個數。實際檢測的包括了第六個氨基酸因變異體突變的各類變異體的糖化血紅蛋白，包含了非β鏈的、只要是N-端為纈氨酸被糖化的所有糖化血紅蛋白。因此，與IFCC定義已經偏離。
回到溯源性的本意，第一、溯源性只強調了參考方法與常規方法，對相同組樣品的比對；第二、比對的樣品事先已經被選擇，去除了所有會產生干擾的所有樣品。第三、只要比對檢測結果，經統計分析得到可比性強烈的結果，可以認可該常規檢測方法對新鮮患者樣品檢測結果量值的溯源性。這樣的比對一致，不說明具有溯源性的分析系統對臨床所有樣品的檢測結果都具有溯源性！
（轉自馮仁豐）
鄂公網安備 42010602004574號
