檢驗質控附件10
新冠病毒樣本采集和檢測技術指南
為指導各級疾控部門和其他相關機構規范開展新冠肺炎病例標本采集與實驗室檢測工作，保證檢測質量，提高檢測效率，特制定本指南。
一、標本采集
（一）采集對象。
新冠肺炎病例、可疑感染人員和其他需要進行檢測的人員，以及可能被污染的環境或物品等。
（二）采樣人員基本要求。
從事標本采集的技術人員應當經過生物安全、監測技術培訓并合格，熟悉標本采集方法，熟練掌握標本采集操作流程。應嚴格按照操作流程進行采樣，按要求做好標本信息記錄，確保標本質量符合要求、標本及相關信息可追溯。
（三）標本采集基本要求。
1.住院病例的標本由所在醫院的醫護人員采集，密切接觸者標本由當地指定的疾控機構、醫療機構負責采集。采集標本時，要根據不同采集對象設置不同的采樣區域，發熱患者前往發熱門診就診、采樣，未設置發熱門診的機構應設置發熱患者專用采樣區域，將發熱患者與其他檢測人群分區采樣，避免交叉感染。
2.無癥狀感染者、入境人員、密切接觸者在隔離觀察期間應采集鼻咽拭子進行核酸檢測，解除隔離時應同時采集2份鼻咽拭子樣本，分別使用不同核酸檢測試劑檢測，2 次檢測原則上由不同檢測機構開展。
3.根據臨床及實驗室檢測工作的需要，可在住院、隔離期間多次采樣，可同時采集呼吸道、血液、便等多種標本。采樣人員應嚴格遵循采樣規范采集標本，保障所采集標本質量符合要求，同時應詳細記錄受檢者信息，可利用條形碼掃描等信息化手段采集相關信息。
4.人群篩查應根據核酸提取、檢測所用試劑的要求確定采樣管，可選擇含病毒滅活劑（胍鹽或表面活性劑等）的采樣管。用于病毒分離的標本應放置于不含有病毒滅活劑的采樣管。
5.物品和環境監測應根據監測目的和防控需求，確定采樣物品、位置與數量，采樣時應嚴格遵循采樣規范。
（四）采集標本種類。
每個病例必須采集急性期呼吸道標本（包括上呼吸道標本或下呼吸道標本），重癥病例優先采集下呼吸道標本；根據臨床需要可留取便標本、全血標本、血清標本和尿標本。物品和環境標本根據監測需求采集。標本種類：1.上呼吸道標本：包括鼻咽拭子、咽拭子等。2.下呼吸道標本：深咳痰液、肺泡灌洗液、支氣管灌洗液、呼吸道吸取物等。3.便標本/肛拭子：留取糞便標本約10克（花生大小），如果不便于留取便標本，可采集肛拭子。4.血液標本：抗凝血，采集量5ml，建議使用含有EDTA抗凝劑的真空釆血管采集血液。5.血清標本：盡量采集急性期、恢復期雙份血清。第一份血清應當盡早（最好在發病后7天內）采集，第二份血清應當在發病后第3～4周采集。采集量5ml，建議使用無抗凝劑的真空采血管。血清標本主要用于抗體的測定，不進行核酸檢測。6.尿標本：留取中段晨尿，采集量2～3ml。7.物體表面標本：包括進口冷鏈食品或進口貨物的內外包裝表面，以及運輸儲藏工具等可能被污染的部位進行涂抹采集的標本。8.污水標本：根據海運口岸大型進口冷凍物品加工處理場所排水系統分布情況，重點選取污水排水口、內部管網匯集處、污水流向的下游或與市政管網的連接處等2～3處點位進行采樣。
（四）標本采集和處理。
1.鼻咽拭子：采樣人員一手輕扶被采集人員的頭部，一手執拭子，拭子貼鼻孔進入，沿下鼻道的底部向后緩緩深入，由于鼻道呈弧形，不可用力過猛，以免發生外傷出血。待拭子頂端到達鼻咽腔后壁時，輕輕旋轉一周（如遇反射性咳嗽，應停留片刻），然后緩緩取出拭子，將拭子頭浸入含2～3ml病毒保存液（也可使用等滲鹽溶液、組織培養液或磷酸鹽緩沖液）的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。
2.咽拭子：被采集人員先用生理鹽水漱口，采樣人員將拭子放入無菌生理鹽水中濕潤（禁止將拭子放入病毒保存液中，避免抗生素引起過敏），被采集人員頭部微仰，嘴張大，并發“啊”音，露出兩側扁桃體，將拭子越過舌根，在被采集者兩側扁桃體稍微用力來回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次，將拭子頭浸入含2～3ml病毒保存液（也可使用等滲鹽溶液、組織培養液或磷酸鹽緩沖液）的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。咽拭子也可與鼻咽拭子放置于同一管中。
3.鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用與負壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。將收集器頭部插入鼻腔或氣管，接通負壓，旋轉收集器頭部并緩慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采樣液沖洗收集器1次（亦可用小兒導尿管接在50ml注射器上來替代收集器）。
4.深咳痰液：要求病人深咳后，將咳出的痰液收集于含3ml采樣液的采樣管中。如果痰液未收集于采樣液中，可在檢測前，加入2～3ml采樣液，或加入痰液等體積的痰液消化液。痰液消化液儲存液配方見表1。
表1 痰液消化液儲存液配方
成分 質量/體積
二硫蘇糖醇 0.1g
氯化鈉 0.78g
氯化磷 0.02g
磷酸氫二鈉 0.112g
磷酸二氫鉀 0.02g
水 7.5ml
PH值 7.4±0.2
（25℃）
使用時將儲存液用去離子水稀釋至50ml，與痰液等體積
混合使用，或者參照試劑說明進行使用，也可采用痰液等體
積的含1g/L蛋白酶K的磷酸鹽緩沖液將痰液化。
5.支氣管灌洗液：將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管（約30cm深處），注入5ml生理鹽水，接通負壓，旋轉收集器頭部并緩慢退出，收集抽取的粘液，并用采樣液沖洗收集器1次，也可用小兒導尿管接在50ml注射器上來替代收集。
6.肺泡灌洗液：局部麻醉后將纖維支氣管鏡通過口或鼻經過咽部插入右肺中葉或左肺舌段的支氣管，將其頂端契入支氣管分支開口，經氣管活檢孔緩緩加入滅菌生理鹽水，每次30～50ml，總量100～250ml，不應超過300ml。
7.糞便標本：取1ml標本處理液，挑取黃豆粒大小的便標本加至管中，輕輕吹吸3～5次，室溫靜置10分鐘，以8000rpm離心5分鐘，吸取上清液進行檢測。糞便標本處理液可自行配制，配方見表2。
表2 糞便標本處理液配方
成分 質量/體積
Tris 1.211g
氯化鈉 8.5g
無水氯化鈣（或含結晶水的氯化鈣） 1.1g （1.47g）
水 800ml
用濃鹽酸調節pH 為7.5，以去離子水補充至1000 ml
也可使用HANK’S液或其它等滲鹽溶液、組織培養液或磷酸鹽緩沖液溶解便標本制備便懸液。如患者出現腹瀉癥狀，則留取糞便標本3～5ml，輕輕吹打混勻后，以8000rpm離心5分鐘，吸取上清液備用。
8.肛拭子：用消毒棉拭子輕輕插入肛門3～5cm，再輕輕旋轉拔出，立即放入含有3～5ml病毒保存液的15ml外螺旋蓋采樣管中，棄去尾部，旋緊管蓋。
9.血液標本：建議使用含有EDTA抗凝劑的真空采血管采集血液標本5ml，根據所選用核酸提取試劑的類型確定以全血或血漿進行核酸提取。如需分離血漿，將全血1500～2000rpm離心10分鐘，收集上清液于無菌螺口塑料管中。
10.血清標本：用真空負壓采血管采集血液標本5ml，室溫靜置30分鐘，1500～2000rpm離心10分鐘，收集血清于無菌螺口塑料管中。
11.物體表面標本：參考《農貿（集貿）市場新型冠狀病毒環境監測技術規范》（WS/T776—2021）推薦的方法采樣拭子充分浸潤病毒保存液后在表面重復涂抹，將拭子放回采樣管浸潤，取出后再次涂抹采樣，重復3次以上。對表面較大的物體進行多點分布式采樣。
12.污水標本：參考《農貿（集貿）市場新型冠狀病毒環境監測技術規范》（WS/T776—2021）推薦的方法，采集污水的拭子樣本時，用拭子浸入吸附污水，將拭子放回采樣管浸潤，取出后再次浸入污水，重復3次以上，對每個污水采樣位置應進行多點分布式采樣。采集污水的水體樣本時，用聚乙烯塑料瓶收集1L～1.5L污水，大于1.5L體積的污水采集，可以使用聚乙烯塑料桶或現場水樣專用富集設備。污水水體樣本采集前，先充分混合均勻后取樣；如果污水難以充分混合，出現分層現象時，可按各層水量的比例分層取樣。
13.其他材料：依據設計需求規范采集。
（五）標本包裝。
標本采集后在生物安全二級實驗室生物安全柜內分裝。
1.所有標本應當放在大小適合的帶螺旋蓋內有墊圈、耐冷凍的樣本采集管里，擰緊。容器外注明樣本編號、種類、姓名及采樣日期。
2.將密閉后的標本裝入密封袋，每袋限一份標本。樣本包裝要求要符合《危險品航空安全運輸技術細則》相應的標準。
3.涉及外部標本運輸的，應根據標本類型，按照A類或B
類感染性物質進行三層包裝。
（六）標本保存。
用于病毒分離和核酸檢測的標本應當盡快進行檢測，可在24小時內檢測的標本可置于4℃保存；24小時內無法檢測的標本則應置于-70℃或以下保存（如無-70℃保存條件，則于-20℃冰箱暫存）。血清標本可在4℃存放3天，-20℃以下可長期保存。應當設立專庫或專柜單獨保存標本。
（七）標本送檢。
標本采集后應當盡快送往實驗室，標本采集后室溫（25℃）放置不宜超過4小時。如果需要長途運輸，建議采用干冰等制冷方式進行保藏。標本運送期間應當避免反復凍融。
1.上送標本。
各省（自治區、直轄市）發現的本土疫情中的首發或早期病例、與早期病例有流行病學關聯的關鍵病例、感染來源不明的本土病例、境外輸入病例、入境物品及相關環境陽性標本等所有原始標本應平行采集至少2份，一份送各省級疾控機構進行檢測，另一份上送中國疾控中心進行檢測、復核，同時附樣本送檢單（見附件10-1）。各省分離到的新的代表性毒株，應及時送中國疾控中心復核、保藏。
2.標本及毒株運輸。
（1）國內運輸。
新冠病毒毒株或其它潛在感染性生物材料的運輸包裝分類屬于A類，對應的聯合國編號為UN2814，包裝符合國際民航組織文件Doc9284《危險品航空安全運輸技術細則》的PI620分類包裝要求；環境樣本屬于B類，對應的聯合國編號為UN3373，包裝符合國際民航組織文件Doc9284《危險品航空安全運輸技術細則》的PI650分類包裝要求；通過其他交通工具運輸的可參照以上標準包裝。新冠病毒毒株或其它潛在感染性材料運輸應按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規定》（原衛生部令第45號）辦理《準運證書》。
（2）國際運輸。
在國際間運輸的新冠病毒標本或毒株，應當規范包裝，按照《出入境特殊物品衛生檢疫管理規定》辦理相關手續，并滿足相關國家和國際相關要求。
（3）標本和毒株的接收及管理。
通過航空進行運送的標本抵達目的地機場后，由專業運輸車輛運送至接收單位，通過陸路運輸的標本由專業車輛進行運送，運送人員和接收人員應對標本進行雙簽收。新冠病毒標本及毒株應由專人管理，準確記錄標本及毒株的來源、種類、數量，編號登記，采取有效措施確保毒株和樣本的安全，嚴防發生誤用、惡意使用、被盜、被搶、丟失、泄露等事件。
二、新冠病毒的實驗室檢測
（一）檢測人員要求。
實驗室檢測技術人員應當具備實驗室工作經歷以及相關專業技術技能，接受過新冠病毒相關檢驗檢測技能培訓。檢測機構應當按照所開展檢測項目及標本量配備實驗室檢測人員，以保證及時、高效完成檢測和結果報告。
（二）實驗室檢測。
1.實時熒光RT-PCR方法檢測新冠病毒核酸。
（1）核酸檢測實驗室。新冠核酸檢測實驗室按功能區布置位置的不同，可分為集中布置形式和分散布置形式。開展新冠病毒核酸檢測的實驗室應當設置以下區域：試劑儲存和準備區、標本制備區、擴增和產物分析區。根據所采用儀器的實際情況，標本制備區、擴增和產物分析區可進行合并。集中布置形式的實驗室設置應遵循“各區獨立，單向流動（注意風向，壓力梯度走向），因地制宜，方便工作”的原則。
各區的功能如下：
①試劑儲存和準備區：用于分裝、儲存試劑、制備擴增
反應混合液，以及儲存和準備實驗耗材。該區應配備冰箱或
冰柜、離心機、試驗臺、渦旋振蕩器、微量加樣器等。為防
止污染，該區宜保持正壓狀態。
②標本制備區：標本轉運桶的開啟、標本滅活（必要時）、核酸提取及模板加入至擴增反應管等。該區應配備冰箱或冰柜、生物安全柜、離心機、試驗臺、微量加樣器，可根據實際工作需要選配自動化核酸提取儀等。標本轉運桶的開啟、分裝應在生物安全柜內完成。為防止污染，該區宜保持負壓狀態。為操作方便，標本的分裝以及核酸提取也可以在獨立的生物安全二級（BSL-2）實驗室進行，提取的核酸可以轉運至該區加至擴增反應液中。
③核酸擴增和產物分析區：進行核酸擴增反應和產物分析。該區應配備實時熒光定量PCR儀。為防止擴增產物污染環境，該區宜保持負壓狀態，壓力等于或低于標本制備區。
（2）新冠病毒核酸的熒光定量RT-PCR檢測。實驗室應當制定標準操作程序（SOP），并嚴格按照SOP進行操作。接到標本后，應當在生物安全柜內對標本進行清點核對，并依據SOP進行試劑準備、標本前處理、核酸提取、核酸擴增、結果分析及報告。實驗室應當建立可疑標本復檢的流程。
①試劑準備。應當選擇國家藥品監督管理部門批準的試劑，建議選擇磁珠法、膜吸附法等進行核酸提取，建議根據核酸提取試劑及擴增體系的要求選擇配套的標本采樣管，不建議免提取核酸直接進行核酸擴增反應。
②標本處理。使用含胍鹽等滅活型采樣液的標本無需進行滅活處理，可直接進行核酸提取，而使用非滅活型采樣液的標本，按照核酸提取試劑盒的說明，取適量標本加至核酸提取裂解液中充分混勻作用一定的時間則可以有效滅活病毒。不推薦采用56℃孵育30分鐘的處理方式滅活病毒，該條件不能保障充分滅活病毒。污水樣本處理可參考《農貿（集貿）市場新型冠狀病毒環境監測技術規范》（WS/T776—2021）推薦的方法。
③核酸提取。將滅活后的標本取出，在生物安全柜內打開標本采集管加樣。或按照核酸提取試劑盒的說明，將標本與裂解液作用足夠時間后繼續核酸提取步驟，核酸提取完成后立即封蓋。取適量核酸加至PCR 擴增反應體系中。
④核酸擴增。將擴增體系放入熒光定量PCR儀，按照試劑盒說明書設置擴增程序，啟動擴增程序。擴增完成后反應管不可開蓋，直接放于垃圾袋中封好袋口，不可高壓，按一般醫療廢物轉移出實驗室處理。
本指南中的核酸檢測方法主要針對新冠病毒基因組中開放讀碼框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核殼蛋白（nucleocapsid protein，N）。
靶標一（ORF1ab）:
正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA
熒光探針（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'
靶標二（N）:
正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
熒光探針（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'
⑤結果判斷。
陰性: 無Ct值、無S形擴增曲線。
陽性：Ct值小于等于檢出限，且有S形擴增曲線，可報告為陽性。
灰區：Ct值位于灰區，建議重復實驗，若重做Ct值仍處于灰區，但出現明顯的S形擴增曲線，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。
注：如使用商品化試劑盒，則以廠家提供的說明書為準。
⑥病例確認。
實驗室確認陽性病例需滿足以下兩個條件中的一個：
條件一：同一份標本中新冠病毒2個靶標（ORF1ab、N）實時熒光RT-PCR檢測結果均為陽性。如果出現單個靶標陽性的檢測結果，則需要重新采樣，重新檢測。
條件二：兩種標本實時熒光RT-PCR同時出現單靶標陽性，或同種類型標本2次采樣檢測中均出現單個靶標陽性的檢測結果，可判定為陽性。環境與生物材料核酸檢測陽性要排除疫苗接種物殘留污染的影響。
核酸檢測結果假陰性的可能原因包括：樣本質量差；樣本采集時間過早或過晚；樣本保存、運輸和處理不當；其他原因如病毒變異、PCR抑制等。
⑦質控。由上級疾控部門對下級疾控實驗室進行核酸檢測質控考核，中國疾控中心每年至少開展一次對省級疾控機構實驗室的質控考核，并同時提供全國新冠病毒實驗室檢測質控方案，省級針對地市級實驗室的質控考核每年不少于2次。各檢測機構應當加強核酸檢測質量控制，選用擴增檢測試劑盒指定的核酸提取試劑和擴增儀。
性能驗證。臨床標本檢測前，實驗室應對核酸提取試劑、提取儀、擴增試劑、擴增儀等組成的檢測系統進行必要的性能驗證，性能指標包括但不限于精密度（至少要有重復性）和最低檢測限。建議選用高靈敏的試劑（檢測限≤500拷貝/ml）。
室內質控。實驗室可按照《國家衛生健康委辦公廳關于
醫療機構開展新型冠狀病毒核酸檢測有關要求的通知》（國衛辦醫函〔2020〕53號）要求規范開展室內質控。每批檢測至少有1 份弱陽性質控品（第三方質控品，通常為檢出限的1.5-3 倍）、3 份陰性質控品（生理鹽水）。質控品隨機放在臨床標本中，參與從提取到擴增的全過程。大規模人群篩查時，一旦出現陽性結果，應對陽性標本采用另外一到兩種更為靈敏的核酸檢測試劑對原始標本進行復核檢測，復核陽性方可報出。物品和環境樣本的采集檢測，還需在采樣前及采樣過程中至少設一個現場空白樣本及一個運輸空白樣本，以進行過程中的質量控制。
室間質評。實驗室應常態化參加國家級或省級疾控機構組織的室間質評。對檢測量大以及承擔重點人群篩查等任務的實驗室，可適當增加室間質評頻率。不按要求參加室間質評的，或室間質評結果不合格的，應通報批評并上報國家衛健委，待室間質評通過后方可開展核酸檢測。
2.病毒全基因組測序。
（1）測序標本選取原則。結合流調信息和病例傳播鏈關系，優先選擇以下標本開展測序：本土疫情中的首發或早期病例、與早期病例有流行病學關聯的關鍵病例、感染來源不明的本土病例、境外輸入病例、入境物品及相關環境陽性
標本、疫苗接種后核酸檢測陽性者標本等。測序結果應與本地近一個月的輸入病例和本土病例序列進行比對。
（2）測序要求。以省為單位確定開展新冠病毒全基因組測序的單位，包括省、市級疾控機構和科研機構。各省要建立本省輸入、本土病例新冠病毒基因組數據庫，應具備序
列對比分析能力。建議首選膜吸附法（人工）提取核酸，以二代測序技術進行新冠全基因組測序。具備測序條件的省份要在接收標本24小時內開展測序工作，關鍵樣本要求收到樣本后一周內提供測序結果報告，并在獲得測序結果后4小時內將基因序列原始數據(一般為fastq格式) 和測序樣本送檢單（見附件10-2）報送中國疾控中心。不具備測序條件的省份要在病例報告后48小時內將病例標本送達中國疾控中心，中國疾控中心在獲得序列信息后24小時內向送樣單位反饋分析結果，并報國家衛生健康委。
（3）上送標本要求。如標本需上送至中國疾控中心進行測序，應同時平行采集2次，混入1管中，然后平均分裝成2份，一份由各省（市）及時開展病毒全基因組測序，另一份應在24小時內啟動送樣程序，上送中國疾控中心。如果需要中國疾控中心進行病毒分離，應確保病毒采樣液中不含有滅活劑成分。
3.血清抗體檢測。
血清抗體檢測（膠體金、磁微粒化學發光、ELISA）用作新冠病毒核酸檢測陰性病例的補充檢測，在疑似病例診斷中與核酸檢測協同使用。建議采集急性期（發病7天內）和恢復期（3-4周后）雙份血清進行檢測，也可根據臨床需要確定采集時間。抗體檢測陽性者應排除新冠疫苗接種因素的影響。
三、實驗室活動生物安全要求
根據新冠病毒傳播特性、致病性和臨床資料等信息，該病毒按照第二類病原微生物進行管理，具體要求如下：
（一）實驗活動規范。新冠病毒培養、動物感染實驗應當在生物安全三級及以上實驗室開展；未經培養的感染性材料的操作應當在生物安全二級及以上實驗室進行，同時采用不低于生物安全三級實驗室的個人防護；滅活材料的操作應當在生物安全二級及以上實驗室進行；不涉及感染性材料的操作，可以在生物安全一級實驗室進行。
（二）相關樣本處置。各省級衛生健康行政部門要根據疫情防控需要和實驗室生物安全有關要求，及時研判提出新
冠病毒實驗室檢測生物樣本處置意見。對確需保存的，應當盡快指定具備保存條件的機構按照相對集中原則進行保存，或送至國家級菌（毒）種保藏中心保藏；對無需保存的，由相關機構按照生物安全有關要求及時處理。
（三）實驗室廢棄物處理及實驗室污染的處理。參考《醫療機構新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊》（試行第二版）。
——國家衛生健康委官網
鄂公網安備 42010602004574號
