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高通量測序實驗室各功能區的基本分區原則

文章來源:發布時間:2019年09月25日瀏覽量: 字體:

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高通量測序包括:實驗室檢測(樣本處理及核酸提取、文庫制備及富集、質檢和測序)和生物信息學分析兩大部分,任何樣本源性污染、barcode源性污染、擴增產物污染或氣溶膠污染均可導致假陰性或假陽性結果的出現。因此,各實驗室應遵循分區一般原則:各區獨立、注意風向、因地制宜、方便工作,依據自己的檢測平臺數量、檢測流程、檢測項目的多少及工作量大小制定切實可行的分區及各區面積大小安排方案。具體的區域數和空間大小具個體化,以“工作有序、互不干擾、防止污染、報告及時”為基本準則。

     各區獨立:即各實驗室區域之間在物理上應永久性處于分隔狀態。高通量測序實驗室至少包括試劑準備區、標本與文庫制備區、文庫擴增與檢測區和測序區,依據不同的檢測平臺和檢測項目,具體分區情況不同。需要注意:不可使用連通各區的中央空調,不可采用家庭裝修模式,不可使用造成門下留有縫隙的上吊推拉門或平開門。傳遞窗應設置雙開,最好一側門關好時,另一側門不能打開。

     注意風向:因為每次擴增后均有大量由標本擴增而來的產物存在。檢測過程中微量離心管子的打開與關閉,以及樣本吸取過程中吹打動作均會造成樣本或產物氣溶膠的形成,極易對其他擴增反應造成污染。為防止擴增產物順著空氣氣流進入上游擴增前的相對“潔凈”區域,可在每個區域設置緩沖間(正壓負壓均可),隔絕實驗室內外空氣。若緩沖間安裝正壓進氣裝置,則緩沖間的氣壓相對高于工作區和外界環境氣壓,使實驗室內空氣不能流出,實驗室外空氣不能流入;若緩沖間安裝負壓排風裝置,則實驗室內或實驗室外的空氣在緩沖間即可被抽走。正壓或負壓緩沖間均可避免工作區域內空氣和外界環境空氣互通。現有很多基因擴增實驗室在分區設計時除了緩沖間有正負壓外,各區內也設置有正負壓,如試劑準備區為一定的正壓(+10Pa,標本制備區正壓稍弱于試劑準備區(+5Pa),其后的各區依次負壓,這是完全沒有必要的,因為緩沖間的正負壓設計已經起到了將各區域空氣流動有效分隔阻斷的作用而且由于區域較多,一直壓力遞增也不合適。各區域最重要的是通風換氣,建議通風換氣次數>10/小時,如果一天內使用同一區域多于兩次,建議有更多的通風換氣次數,有助于殘留DNA“污染”的清除。

     因地制宜:高通量測序實驗室的分區設計沒有固定模板,不是千篇一的,必須依據具體情況具體分析。各區之間最重要的是物理分隔,既可以相互鄰近,也可以分散在同樓層的不同處,甚至可以分散在不同的樓層。對于新建實驗室應盡可能做到合理,易于管理。對于舊的實驗室不必強求理想狀態,可根據原有實驗室的分布現狀及空間大小進行合理安排,只要符合各區獨立,注意風向,方便工作的原則即可。

     方便工作 :對高通量測序實驗室進行嚴格的分區設計是為了在物理上防止污染的發生。但同時也應最大限度的考慮各區域分隔設計及空間和區域面積大小的合理性是否方便日常檢測工作。除此之外,大型儀器設備的進出是否方便也是分區時應考慮的。
      工作有序:保證實驗室 檢測獲得可靠結果的重要前提條件之一。試想如果一個實驗室的區域和檢測流程的安排,因為多個檢測平臺的存在、檢測流程的差異而處于一種混亂狀況, 會大大增加出現差錯的可能性。通常實驗室不會只有 1個檢測項目或檢測panel,工作量的差異也可能較大,但作為高通量測序實驗室,工作量過小,則起不到高通量檢測的作用,工作量大,則意味著實驗室儀器設備的數量增加,較大型自動化儀器設備配置,一天內各區域可能重復使用等,為保證工作有序,對區域面積大小,甚至區域數量,都會有額外的要求。

   互不干擾、防止污染和報告及時:高通量測序實驗室由于檢測項目和檢測流程的不同而出現相互干擾的可能性必須要考慮,一旦工作出現相互干擾, 也就很難防止污染的發生,也不太可能及時發出檢測報告。例如,一個高通量測序實驗室同時開展NIPSANIPT、遺傳病和腫瘤基因突變(組織和血漿ctDNA)檢測,為了避免不同檢測項目之間相互干擾,以及高濃度組織樣本核酸提取及后續擴增和雜交捕獲等過程中出現的氣溶膠,對低濃度游離DNA樣本核酸提取造成的交叉污染,還需要設置多個標本制備區及相應后續擴增等區域。又如,進行NIPS/NIPT的實驗室,由于從血漿中提取的是母體血漿CfDNA.其中胎兒cffDNA相對微量,為防止組織提取高濃度DNA污染,造成胎兒cffDNA的百分比更低,現假陰性結果,因此涉及高濃度組織或細胞DNA提取項目的標本制備區不可與其共用。此外,遺傳病和腫瘤把向藥物治療的高通量測序檢測過程較NIPS/NIPT要復雜許多。需進行更加細致區域劃分,至少應包括試劑準備區、標本與文庫制備區、雜交捕獲區、文庫擴增區和測序區等。若組織樣本在測序前需要進行包埋處理及HE染色判斷樣本質量腫瘤細胞含量及百分比),則應增設樣本制備前區。若使用不同的雜交捕獲方法對不同類型的樣本進行捕獲,為避免交叉污染,應設置多個雜交捕獲區。在文庫制備過程中,若需要進行不同目的核酸的多次擴增,則應將擴增區合理劃分為擴增一區、擴增二區等。由于樣本DNA提取、DNA片段化后質量鑒定及DNA純化和回收等步驟均需要用到電泳,從節省儀器設備費用的角度,可以考慮單獨設置一個電泳區放置Agilent生物分析儀和()凝膠電泳儀:不同檢測項目、不同檢測平臺的電泳

可以在此區共同完成。區域的設置也與日常工作量及檢測過程的自動化程度相關。此外,實驗室設計還要考慮高通量測序檢測結果的確認方法運行的空間和區域問題,遺傳病的靶向測序外顯子和全基因組測序一般都會涉及些測序區域出現的陽性序列結果的確認,確認方法一般采用Sanger測序,一代測序儀可與高通量測序儀放在一個區域 ,但Sanger測序前的擴增產物電泳及純化可放在單獨設置的電泳區內。除此之外,腫瘤基因突變的靶向測序、全外顯子測序等也可能涉及確認實驗,通常的確認方法為PCR基因芯片、數字PCRARMS、高分辨熔點曲線分析或另一經過驗證的高通量測序方法等,需要考慮這些確認實驗相應儀器設備和工作流程有造成工作干擾和交叉污染發生的可能,從而合理安排這些儀器設備的放置區域和工作流程。

    高通量測序實驗室的每一區域都須有明確的標記,各區的儀器設備及工作服、鞋、實驗記錄本和筆等都必須專用,不得混淆。此外,每個工作區域內還應有固定于房頂的紫外燈和可移動紫外燈,以便于對工作后的區域進行照射,減少上一次標本檢測遺留核酸及擴增產物的污染。    


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