室內比對PCR實驗室核酸檢測的常見問題
檢驗科人員是核酸檢測工作的主力軍，我們不但要保證檢測結果的有效性，還時刻面臨著被感染的風險。本文為大家講解《PCR實驗室新冠核酸檢測操作注意事項》，重點從新冠病毒生理特性、熒光PCR原理、PCR實驗室籌備規范、樣本檢測環節操作、實驗室數據分析、常見問題解析等幾個方面討論學習。
1、傳染源
目前所見傳染源主要是新型冠狀病毒感染的患者。無癥狀感染者也可能成為傳染源。
2、傳播途徑
經呼吸道飛沫和密切接觸傳播是主要的傳播途徑。在相對封閉的環境中長時間暴露于高濃度氣溶膠情況下存在經氣溶膠傳播的可能。由于在糞便及尿中可分離到新型冠狀病毒，應注意糞便及尿對環境污染造成氣溶膠或接觸傳播。
3、熒光PCR原理
重復進行“變性 - 退火 - 延伸” 三個過程，模板DNA的量就會呈指數倍增加，理論上講經過 n 個循環之后，模板量就會達到2的n次方。
4、常見問題解析
①新冠試劑出現翹尾，怎么處理？
答：如果是個別單一通道翹尾，不管是FAM還是VIC通道，首先按照要求復查，復查建議重新采樣，如果不方便重新采樣建議對原有樣本進行重新提取核酸驗證，如果復查陰性判讀陰性，如果復查還是同一通道翹尾，就要對結果仔細審核，一是要排除實驗室污染，二是要對病人信息了解清楚，從臨床癥狀及接觸史排查，如果沒法確認，建議必須重新采樣復查，如有必要可以采用另一家試劑來驗證。如果出現大量的弱陽性擴增翹尾，首要原因是考慮實驗室污染，可以通過做環境樣本和陰性對照做驗證排除。
②N基因和1ab基因是新冠病毒的特有基因嗎，靈敏度哪個更高？是否會和其他冠狀病毒片段重疊？
答：N基因跟1ab都是特異的，不會跟其他呼吸道病原體交叉反應。設計時候，兩個基因的序列不一樣，導致靈敏度不一樣，N基因的靈敏度比1ab靈敏度高。
③新冠檢測結果和臨床診斷不符合，怎么解讀？
答：新冠病毒由于是RNA病毒，容易降解，另外檢測結果也和取樣，核酸提取以及樣本本身的核酸濃度有關，需要逐一分析，同時可以結合臨床癥狀判讀。
④采用生理鹽水做陰性對照，內標也會增長，怎么解釋？
答：因為試劑采用的是內源性內標，內源性內標是用人源基因標記，此基因存在于人的表皮細胞內，操作過程中就可能會出現人源性的污染，另外環境污染也有可能導致內標增長，這也是前面提到的建議做環境樣本質控。
⑤新冠樣本內標不出如何處理？
答：如果新冠樣本內標不出，該樣本必須復查，可重新混勻該樣本提取核酸，如果重新提取該樣本內標還是不出，在排除提取問題的情況下，說明采樣不合格，要通知臨床重新采樣復查。
⑥采集環境樣本檢測新冠狀病毒，為啥大部分樣本內標不出，偶爾個別樣本檢測出內標？
答：因為新冠試劑檢測的是人內源性內標，環境樣本一般不含有人源細胞，所以檢測不出內標；偶爾檢出內標，可能該環境樣本上有人源性細胞粘附，故而檢出內標。
（文章來源于基層檢驗網公眾號）
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